水胺硫磷半抗原分子的設計及其免疫效果*

劉波，袁利鵬，林丹瓊，熊波，高秀杰

1(廣東農工商職業技術學院熱作系，廣東 廣州，510507)2(廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東順德，528300)

3(中山大學 達安基因股份有限公司，廣東廣州，510665)

水胺硫磷(isocarbophos，ICP)，手性有機磷農藥(organophosphorus pesticides，OPs)的一種，由于具有殺蟲效率高，堿性條件下易分解等優點，一度成為農業生產中的主要殺蟲劑之一。但ICP的濫用，不僅會造成農藥在環境中的殘留，還可通過食物鏈的富集作用使動物和人中毒，進而對人體的代謝平衡產生影響，尤其是對兒童神經系統的正常發育產生更為嚴重的影響［1-2］。2010年海南發生的“毒豇豆”事件，其元兇就是ICP。

目前，水胺硫磷的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)［3］、氣相色譜法(GC)［4-5］、液相色譜-電噴霧串聯質譜法(LC-ESI-MS/MS)［6-7］等。這些方法雖然具有很好的準確度和靈敏度，但需要昂貴的檢測設備，且樣品的前處理操作較繁瑣，單個樣品的檢測耗時長，不能快速提供檢測結果。因此建立一種新的快速、靈敏、檢測成本低的檢測ICP方法，尤其是痕量ICP的檢測方法，是目前分析化學需要研究的重要課題。近年來，免疫分析技術已經越來越廣泛地應用于農獸藥殘留分析和摻偽食品鑒定領域，以其簡單、廉價、快捷、靈敏度高、適用于大批量樣品檢測等優點而成為一種重要的分析方法。目前國內外尚未見ICP的免疫化學檢驗方法及產品的報道，本研究設計合成了ICP半抗原，并制備了抗ICP多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 主要試劑

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)，美國Sigma公司;水胺硫磷及其相關標準品，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH;羊抗兔IgG-HRP，購于博士德公司;三氯硫磷，西亞試劑公司;二環已基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和其他化學試劑，阿拉丁試劑公司;包被緩沖液(0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)、封閉液(含1% 明膠的0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)、洗滌液 PBST(含0.05%Tween-20的0.01 mol/L，pH 7.4的PBS)、底物緩沖液(pH 5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液)、底物TMB(2 mg/L DMSO)、終止液(2 mol/L H2SO4)，均為實驗室配制。

1.1.2 實驗動物

新西蘭大白兔2只，雌性，體重3 kg以上，購自廣東省實驗動物中心。

1.1.3 主要儀器

HP1100液質聯用儀，美國，Agilent;多功能酶標儀，美國，Perkin Elimer;Wellwash MK2洗板機，美國Thermo;UV-2450紫外-可見分光光度計，日本島津分析儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 半抗原的合成及結構鑒定

合成方法如圖1所示。稱取10.4 g水楊酸放入圓底燒瓶，然后依次加入4.5 L濃H2SO4和20 mL無水異丙醇，油浴加熱至100℃冷凝回流12 h后冷卻至室溫加水稀釋，用乙酸乙酯萃取3次，每次用乙酸乙酯20 mL，合并有機層用飽和NaHCO3洗滌2遍，最后再用飽和食鹽水洗1遍，有機層用無水Na2SO4除水干燥后用旋轉蒸發器蒸干有機溶劑得到淺黃色水楊酸異丙酯。

圖1 水胺硫磷半抗原H-ICP的合成路線Fig.1 The synthesis scheme of H-ICP hapten

用量筒量取15 mL三氯硫磷于圓底燒瓶中，在-5～0℃強烈攪拌下緩慢加入30 mL無水甲醇反應2 h，產物用冰水振搖2～3次除去甲醇和產生的HCl，有機層用無水Na2SO4除水干燥后得到無色透明液體O-甲基硫代磷酰二氯，低溫保存備用。

稱取水楊酸異丙酯2 g加入10 mL二氯甲烷和60 mg四丁基溴化銨冷卻至0℃左右，攪拌下逐滴加入4 g O-甲基硫代磷酰二氯，加熱升至室溫，再滴加20%的NaOH溶液，反應過程用pH試紙監控使溶液pH值保持在11左右，反應4 h后分離出二氯甲烷相蒸干，過柱純化得到產物O-甲基-O-2-水楊酸異丙酯硫代磷酰一氯。

稱取O-甲基-O-2-水楊酸異丙酯硫代磷酰一氯500 mg，加入5 mL二氧六環，置于0℃下攪拌，攪拌下逐滴加入2 mL溶有170 mg NaOH和210 mg 6-氨基己酸，隨后加熱升溫至室溫;反應4 h后點板監控，待反應完全后用稀鹽酸將溶液的pH值調至酸性，用三氯甲烷萃取蒸干得到淺黃色油狀物，過柱純化得到終產物H-ICP。

由圖2可見，在APCI-MS正離子譜圖中存在m/z為403.9的質譜峰，該產物相對分子質量與目標產物的相對分子質量403.1一致，結合反應路線，可以推斷合成產物即為所需的目標半抗原，說明該合成路線可以用于水胺硫磷半抗原的合成。同時可見，403.9的分子離子峰是最強峰，表明新產物為反應體系中的主要物質，說明反應產物具備相對較高的純度。

圖2 水胺硫磷半抗原H-ICP的質譜圖Fig.2 The mass spectrum of H-ICP hapten

1.2.2 人工抗原制備與鑒定

采用活潑酯法制備免疫原H-ICP-BSA、包被原H-ICP-OVA，抗原鑒定采用文獻［8］的方法進行。在波長200～400 nm區間，對各人工抗原的紫外吸收光譜進行測定，鑒定半抗原與載體蛋白(BSA或OVA)是否偶聯成功［9］。

人工抗原的紫外掃描結果表明，與相應載體蛋白BSA或OVA比較，偶聯產物的最大紫外吸收峰在波長215～225 nm或270～280 nm范圍發生了明顯變化，其中由半抗原與蛋白質偶聯所得到的人工抗原在225～250 nm內出現了強吸收峰，與相應蛋白的吸收峰比較，發生了紅移，可能是由于這些半抗原具有共軛結構，在250 nm左右有強吸收峰或吸收帶所引起的。

圖3 H-ICP人工抗原紫外掃描譜圖Fig.3 UV spectrum of H-ICP artificial antigens and hapten

1.2.3 多克隆抗體的制備

選取2只新西蘭雌性大白兔用免疫原H-ICPBSA進行免疫，免疫劑量為500 μg/只。首次免疫，取抗原與弗氏完全佐劑乳化，采用背部多點免疫健康大白兔。間隔3周，取抗原與弗氏不完全佐劑乳化，加強免疫。以后免疫每隔2周進行免疫。取耳緣靜脈血，采用ELISA方法測定抗血清效價。待效價穩定后，再加強免疫一次。最后一次免疫后10 d心臟采血，室溫靜置1 h，再置4℃冰箱12 h，4 000 r/min離心10 min，收集血清，-20℃保存。

2 結果與分析

2.1 半抗原的設計合成

根據分析，手臂位點和ICP特征結構將成為ICP半抗原設計的關鍵點，這也是研究ICP農藥免疫速測技術的關鍵點。考慮到ICP主要有2部分特征結構組成，即甲氧基硫代磷酸酯部分和苯環部分，其中從硫代磷酸酯部分衍生出的手臂不但可以最大化的保留其特征結構，而且在與載體蛋白偶聯后使苯環部分也充分的暴露出來可以增強免疫原性(見圖1)。

2.2 抗體靈敏度的測定

采用間接競爭ELISA工作程序測定抗血清對ICP的競爭曲線，參照劉鳳權等人［10］的方法，并采用Originlab 7.5的四參數擬合模塊對間接競爭ELISA反應曲線進行 S擬合，計算曲線IC50值，以H-ICPOVA為包被原，建立間接ELISA標準曲線(見圖4)。該方法的IC50為5.3 ng/mL，檢定量線性范圍(IC20～IC80)為1.77～10.06 ng/mL。

圖4 水胺硫磷的間接ELISA標準曲線Fig.4 The icELISA standard curve of ICP

2.3 抗體的特異性研究

采用間接競爭ELISA程序在同等條件下依次建立水胺硫磷及其類似物的標準品ELISA曲線，求出各自抑制率為50%時的標準品濃度，用IC50表示，然后再換算成摩爾濃度后用公式計算出每種結構類似物與抗體的交叉反應率，則:交叉反應率/%=(水胺硫磷IC50/類似物IC50)×100

由表1可以看出所制備的抗體特異性非常好，獲得的抗血清和其他結構類似物均無交叉反應，可用于果蔬中水胺硫磷的快速檢測。

表1 水胺硫磷與結構類似物的交叉反應率結果(n=3)Table 1 Cross reactivity of ponoclonal antibody with analogous compound of ICP(n=3)

3 討論

本實驗通過設計合成水胺硫磷半抗原、制備人工抗原合成、動物免疫，首次獲得針水胺硫磷的多克隆抗體，且該抗體對結構類似物均無明顯的交叉反應，說明半抗原的結構設計合理，并為其單克隆抗體的研制、酶免分析方法的建立以及環境、食品中農藥殘留的快速檢測提供了具有一定價值的研究基礎和技術。

［1］ Pehkonen S O，ZHANG Q.Critical Revi Environm［J］.Science and Technology，2002，32(1):17

［2］ 顏曉娜，許金生，王麗麗，等.水胺硫磷分子印跡傳感器的制備與應用［J］.分析試驗室，2012，32(2):41-46

［3］ 葉江雷，弓振斌，林芳，等.茶葉中水胺硫磷、亞胺硫磷、甲基對硫磷和伏殺硫磷農藥殘留的高效液相色譜法測定［J］.廈門大學學報，2007，46(3):441-444.

［4］ 樓國柱，徐倩，白曉榮，等.不同提取劑對茶葉中多種農藥殘留檢測影響的研究［J］.食品科學，2004，25(12):165-168.

［5］ 楊小鋼，鄺培翠.氣相色譜法測定蔬菜和小麥中乙基異柳磷和水胺硫磷兩種農藥殘留量［J］.湖北醫科大學學報，1995，16(1):3-5

［6］ Roger J，Hassan S，Emmanuel S，et al.Application of liquid chromatography with mass spectrometry combined with photodiode array detection and tandem mass spectrometry for monitoring pesticides in surface waters［J］.Journal of Chromatography A，2000，879(1):51-71.

［7］ Otero R R，Grande B C，Gandara J S.Multiresidue method for fourteen fungicides in white grapes by liquid-liquid and solid phase extraction followed by liquid chromatography-diode array detection［J］.Journalof Chromatography A，2003，992(1/2):121-131.

［8］ Cho Y A，Kim Y J，Hammock B D，et al.Development of a microtiter plate ELISA and a dipstick ELISA for the determination of the organophosphorus insecticide fenthion［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(27):7 854-7 860.

［9］ Singh K V，Kaur J，Varshney G C，et al.Synthesis and characterization of hapten-protein conjugates for antibody production against small molecules［J］.Bioconjugate Chemistry，2004，15(1):168-173.

［10］ 劉鳳權，許志剛，王金生.定量測定甲胺磷殘留的間接競爭ELISA的建立和初步應用［J］.農業生物技術學報，1998，6(2):140-146.