β-半乳糖苷酶選擇性催化人參皂苷Rg3水解制備Rh2初探*

萬會達，李丹，張玨

1(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，化學與材料工程學院，江蘇無錫，214122)

2(江蘇省原子醫學研究所，江蘇 無錫，214063)

人參皂苷是人參(Panax ginseng)中一類提高免疫力，抗疲勞，抗腫瘤的活性物質，目前已經分離和鑒定出超過100種的人參皂苷［1-2］。人參皂苷類物質均具有17個碳原子排列成4個環的甾烷類固醇苷元，在苷元上連接不同種類和數量的糖基，形成具有各種理化性能的人參皂苷。構效關系研究表明，主要人參皂苷(Rb1，Rg1，Re等)的代謝水解產物，通常被稱為次級苷，具有更高的生物利用度和藥理活性。如人參皂苷Rh2為Rg3水解一個葡萄糖基所得的次級苷(式1)，其生物利用度明顯強于Rg3［3］。在自然界中由于次級苷含量稀少，因而已經有多種方法用于稀有次級苷的制備，例如化學法，生物酶催化法，微生物轉化法等［4-6］。人參皂苷中多個糖苷鍵均有可能被水解，而生物酶催化法具有高選擇性，反應條件簡單溫和等特質，成為目前次級苷制備研究的主要方向之一［7-9］。β-半乳糖苷酶(β-D-galactoside galactohydrolase，β-galactosidase，EC 3.2.1.23)是一種常見的 β-糖苷水解酶，可以催化乳糖水解和轉苷兩種反應，已經在食品加工、乳品飲料、生物醫藥制造等領域中廣泛應用［10-11］。不同來源的 β-糖苷水解酶同時具有多種催化活性，如水解β-半乳糖苷鍵、β-葡萄糖苷鍵、β-果糖苷鍵等。此外，大多數人參皂苷水溶性差，如Rg3在水中幾乎不溶(＜0.02 mg/mL)，成為制約水相酶催化制備次級苷的“瓶頸”。化學修飾可以提高人參皂苷的溶解性，但分子結構發生變化;加入甲醇等有機溶劑助溶無疑會導致酶失活。羥丙基-β-環糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)包合法能夠提高包括人參皂苷在內的多種疏水性物質的溶解度，且無毒副作用，已經被FDA批準可以用于食品和醫藥等領域中［12-13］。本文嘗試先包合Rg3，后以來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶催化水解的方法制備Rh2，初探了加酶量、反應時間、底物對水解反應的影響(式1)。

式1 β-半乳糖苷酶選擇性催化水解Rg3制備Rh2Scheme 1 Transformation pathway from ginsenoside Rg3 to Rh2 using β-galactosidase

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

β-半乳糖苷酶(來源于Aspergillus sp.)由江南大學吳敬教授課題組提供;人參皂苷 Rg3-30粗品(30%，HPLC)由撫松縣大自然生物有限公司惠贈;人參皂苷Rg3-90(S型，≥90%，HPLC)，人參皂苷標準物Rg3-98和Rh2-98(S型，≥98%，HPLC)購于江蘇澤朗生物醫藥有限公司;羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD，1 522.6 g/mol)購于山東淄博千匯生物科技有限公司;鄰硝基苯酚(oNP，99%)和對硝基苯酚(pNP，99%GC)購于上海晶純生化科技股份有限公司;對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，98%)，鄰硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(oNPG，99%)，購于上海寶曼生物科技有限公司;乙腈(色譜純)，購于美國J.T.Baker公司;其他化學試劑(AR)購于國藥集團化學試劑有限公司。

紫外可見分光光度計(T6新世紀)，北京普析通用儀器有限公司;往復式水浴搖床(HZ-8812S-B)，太倉市華利達實驗設備有限公司;超級恒溫水槽(DKB-501A)，上海森信實驗儀器有限公司;液相色譜儀(2695，二極管陣列檢測器996)和液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜儀(MALDI SYNAPT QTof MS)，美國Waters公司;場發射掃描電子顯微鏡(SEM，S-4800)，日立公司。

1.2 方法

1.2.1 β-半乳糖苷酶酶活測定

oNPG水解酶活測定:依次在5 mL離心管中加入1.8 mL醋酸緩沖液(pH 4.6);再加入100 μL稀釋數倍的酶液(空白不加酶)，37℃下預熱10 min，加入oNPG(20 mmol/L)底物100 μL，計時反應10 min;加入1 mL Na2CO3(1 mol/L)終止反應;在420 nm處測定其吸光度，根據鄰硝基苯酚oNP標準曲線(y=0.229 2×OD值，R2=0.999 2)計算酶活。

pNPG水解酶活測定:依次在5 mL離心管中加入1.8 mL醋酸緩沖液(pH 4.6);再加入100 μL稀釋數倍的酶液(空白不加酶)，37℃下預熱10 min，加入pNPG(20 mmol/L)底物100 μL，計時反應10 min;加入1 mL Na2CO3(1 mol/L)終止反應;在405 nm處測定其吸光度，根據對硝基苯酚pNP標準曲線(y=0.058 3×OD值，R2=0.999 8)計算酶活。

酶活(U)定義為:在上述反應條件下每分鐘生成1 μmol oNP或pNP所需要的酶量(g)。

1.2.2 Rg3 相溶解度曲線［14］

根據Higuchi和Connors提出的相溶解度法測定Rg3的相溶解度曲線:配制不同濃度的HP-β-CD水溶液，分別加入過量的Rg3-98，然后在一定溫度下(45℃，55℃或65℃)充分振蕩平衡24 h;離心取上清液，HPLC外標法測定Rg3的濃度;以HP-β-CD濃度為橫坐標，Rg3濃度為縱坐標，繪制相溶解度圖，根據相溶解度曲線的回歸方程可得曲線的斜率。

1.2.3 Rg3 包合物制備［15］

配制HP-β-CD(200 mg/mL)水溶液，60℃下恒溫;將20 mg/mL Rg3-90逐滴加入到 HP-β-CD溶液中;持續攪拌2 h后再在25℃下攪拌3 h;在70℃下真空干燥即可得Rg3包合物。計算Rg3的回收率和包合率。同樣方法制備Rg3-30粗品的包合物。

1.2.4 包合物表征

場發射掃描電子顯微鏡觀察包合前后樣品的形貌，加速電壓1.0 kV，真空狀態下噴金1 min;HPLC含量測定:Waters 2695，二極管陣列檢測器(waters 996)，檢測波長 205 nm;C18柱(Lichrospher C18，4.6 mm×250 mm，5 μm);梯度洗脫75%乙腈水溶液(0 min)到50%乙腈水溶液(25 min);流速1 mL/min。

1.2.5 β-半乳糖苷酶催化水解Rg3水解反應

配制25 mg/mL的Rg3-90包合物溶液，在60℃下恒溫0.5 h;加入來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶(250 U/g Rg3，500 U/g Rg3)并計時反應，定時取樣進行HPLC分析;反應結束后，對反應液進行LC-MS分析:色譜條件為BEH HILIC色譜柱，柱溫為30℃，流速為0.3 mL/min，梯度洗脫30%乙腈水溶液(0 min)，100%乙腈水溶液(11～13 min)，30%乙腈水溶液(13.1 min)，進樣量1 μL，進樣濃度為1 mg/mL;質譜條件為碰撞電壓6 eV;離子化方式電噴霧電離(ESI)，負離子檢測模式，分子質量范圍200～2 000)。

以Rg3-30為底物時，包合物濃度為100 mg/mL，其他條件同上。

2 結果與討論

2.1 Rg3包合物的制備

來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶直接催化水解Rg3時，未檢測出有產物生成，推測是由于Rg3在水中的溶解度低導致，25℃時僅為0.017 mg/mL;雖然甲醇能助溶，但β-半乳糖苷酶失活，仍無產物生成。所以首先采用包合法提高Rg3溶解度，然后再進行水相酶催化反應。選用的包合劑為HP-β-CD，Rg3包合物收率為88.2%，Rg3含量為2.45%。圖1a為Rg3的掃描電鏡圖;由圖1b和圖1d可知HP-β-CD具有球狀孔隙結構，Rg3包合之后呈現較大的片狀結構，均不同包合之前的形貌;圖1c為二者物理混合物(水溶性并沒有明顯提高)的SEM，HP-β-CD的球狀孔隙結構仍然存在，因而推測Rg3包合物已經制備得到。

25℃下的溶解度實驗表明包合后，Rg3在水中的溶解度至少提高74.6倍，達到1.2 mg/mL。根據Higuchi和Connors提出的相溶解度法測定Rg3的相溶解度曲線，隨HP-β-CD濃度增加，被包合的Rg3濃度也成線性增加(圖2)。根據分類，可知Rg3的包合類型屬于典型的AL型，并且Rg3與HP-β-CD之間形成了1∶1的包合物。

圖1 Rg3(a)，HP-β-CD(b)，HP-β-CD/Rg3 物理混合物(50∶1 w/w)(c)，Rg3/HP-β-CD 包合物(d)的 SEMFig.1 SEM micrographs of Rg3(a)，HP-β-CD(b)，HP-β-CD and Rg3 physical mixture(50∶1 mass ratio)(c)and Rg3/HP-β-CD complex(d)

圖2 Rg3的相溶解度曲線Fig.2 Phase solubility curve of Rg3

2.2 來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶催化水解Rg3

測得來源于 Aspergillus sp.的 β-半乳糖苷酶的oNPG水解酶活為14 U/g，而pNPG水解酶活為6 540 U/g。以Rg3-90包合物為底物，考查β-半乳糖苷酶催化Rg3水解的反應。由圖3可知只有一個產物生成，并且其與Rh2-98標準物的保留時間相同，結合質譜信息(m/z:829.6，［MRg3+COOH］-;m/z:783.6，［MRg3-H］-;m/z:667.5，［MRh2+COOH］-)，確定產物為Rh2。說明HP-β-CD包合并未阻斷水解反應，來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶能夠選擇性催化水解Rg3中的β-1，2糖苷鍵，不會進一步水解水解苷元與槐糖基之間的糖苷鍵而得到原人參二醇。

圖3 Rg3水解過程取樣的LC-MSFig.3 LC-MS profiles of Rg3 hydrolysis reaction

60℃下考查加酶量和反應時間對水解反應的影響，加酶量按照oNPG水解酶活加入，Rg3-90包合物濃度為25 mg/mL。由圖4可知，反應24 h左右達到平衡。當加酶量提高1倍，初始反應速率加快，并且Rg3轉化率和Rh2產率均提高1.6倍，Rg3的轉化率達90.6%，Rh2的產率為88.5%。文獻報道來源于Fusarium proliferatum ECU2042的β-葡萄糖苷酶(Rg3的轉化率為60%)和來源于 Esteya vermicola CNU 120806的粗酶液(Rg3的轉化率為90%，未提及產率)同樣可以催化Rg3變成Rh2，但生物酶來源不常見，且忽視Rg3的溶解性問題［16-17］。

圖4 β-半乳糖苷酶催化水解Rg3-90的進程Fig.4 Time course of enzymatic transformation of Rg3

市售Rg3純度不高，還含有多種人參皂苷。選取Rg3-30粗品，同樣先包合后在60℃下β-半乳糖苷酶催化Rg3-30包合物(100 mg/mL)水解。經包合后，Rg3-30溶解度提高了65倍，說明除Rg3以外的人參皂苷也可以與HP-β-CD發生包合。由圖5可知，結合標準品的HPLC，Rg3(16.87 min)水解生成Rh2(23.12 min)，反應后期Rh2會以沉淀形式析出(圖5e)。此外還發現18.96 min和19.21 min對應的人參皂苷未知物未發生變化，19.96 min和20.39 min對應的人參皂苷未知物反應前后峰面積減少，說明在β-半乳糖苷酶作用下也發生了反應。因此需要進一步以高純度人參皂苷為底物并結合各種表征手段，繼續考查來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶催化水解制備其他次級苷的性能。

圖5 β-半乳糖苷酶催化水解Rg3-30的HPLCFig.5 HPLC profiles of Rg3-30 hydrolysis reaction

3 結論

本文先用羥丙基-β-環糊精包合Rg3，Rg3在水中的溶解度提高了74.6倍，包合屬于AL型，形成1∶1的包合物。然后以Rg3包合物為底物，初探了來源于Aspergillus sp.的 β-半乳糖苷酶催化水解制備Rh2。當加酶量為500 U/g Rg3，60℃下反應24 h，Rg3的轉化率達90.6%，Rh2的產率為88.5%。本文提供了一種新的高效制備Rh2的方法。

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