糞腸球菌耐熱型保護劑的篩選及加速儲存穩定性研究

李衛娟，王計偉，王宇霄，劉春雪，洪平

(安佑生物科技集團股份有限公司，江蘇 太倉，215437)

糞腸球菌是從動物腸道里分離出來的一種具有良好生物安全性及益生特性的腸道益生菌，可直接參與宿主的物質代謝。其生長速度快，每19 min分裂1次，代謝過程中會分泌L-型乳酸、腸球菌素等非特異性免疫調節因子，并產生多種對動物生長有利的營養物質［1-2］，因而常作為微生物飼料添加劑來增強動物腸道健康。然而其耐熱穩定性較差，經飼料高溫制粒及貯藏后，活菌數大大下降。一般來講，飼料中益生菌的數量應在106/g以上才能使其順利到達腸道并發揮作用［3］，因此需要對提高糞腸球菌耐熱穩定性的技術進行研究。

目前國內外在提高益生菌熱穩定性方面已開展了大量的研究，主要包括菌種誘變、基因改造、微膠囊、保護劑等技術。關于保護劑方面的研究多集中于液態發酵的益生菌，關于固態發酵的益生菌保護劑的研究則相對較少。采用固態發酵生產的益生菌在穩定性方面通常較液態發酵的益生菌要好，一方面固態發酵基質可作為營養基質，另一方面可作為包埋基質對菌體進行包埋保護［4］。為了驗證保護劑的保護效果，最可靠的方法是常溫貯藏。但歷時較長，為了快速獲得結果，常采用加速儲存穩定性試驗。加速儲存穩定性試驗常用于預測凍干的動植物病毒及不同的微生物儲藏穩定性，以便在短時間內獲得儲藏數據［5-6］

本研究在固態發酵的基礎上優化糞腸球菌耐熱型保護劑配方，并通過加速儲存試驗，建立儲存穩定性方程來預測其儲存壽命，為工業化生產中該產品有效活菌數的快速預測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

糞腸球菌(Enterococcus faecalis):中國工業微生物菌種保藏管理中心。

海藻糖為食品級，美國RSG公司;抗壞血酸鈉、甘油為分析純;脫脂奶粉，伊利高蛋白脫脂高鈣奶粉。

種子培養基(g/L):蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母膏5.0，檸檬酸氫二銨2.0，葡萄糖20.0，乙酸鈉5.0，K2HPO42.0，MgSO40.58，MnSO40.25，蒸餾水1 L，加入吐溫80 1.0 mL，pH 6.26，121 ℃滅菌15 min。

固態發酵培養基(g/kg):麥麩940，豆粕40，玉米粉20，121℃滅菌30 min。

營養液(g/kg固態發酵培養基):酵母膏2.5，蛋白胨 5.0，葡萄糖 10.0，牛肉膏 3.0，MgSO40.5，K2HPO40.5，500 mL自來水溶解，121℃滅菌15 min。

檢測培養基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏5，葡萄糖20，NaCl 5，瓊脂粉15，pH 6.5，121 ℃滅菌 15 min。

1.2 糞腸球菌耐熱型保護劑的篩選

1.2.1 糞腸球菌固態發酵樣品制備

將活化后的種子液以10%的接種量與營養液一起接種至固態發酵培養基中，混勻后于37℃培養12 h。

1.2.2 保護劑的優化

根據前期試驗結果及文獻資料［7-12］，選用甘油、海藻糖、脫脂奶粉、抗壞血酸鈉作為保護劑的成分，采用正交試驗對保護劑的配比進行優化。試驗設計見表1。將各組成分以少許等量無菌水溶解后，分別與發酵完畢的糞腸球菌樣品混勻，40℃烘干收集。

表1 保護劑篩選正交試驗設計Table 1 The orthogonal experimental design for protectants screen

1.2.3 耐熱型復合保護劑保護效果評價

采用人工耐熱性試驗對上述各試驗組保護劑的保護效果進行評價。測定方法:將含有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶置于60℃水浴鍋中預熱20～30 min，使瓶內溫度與水浴鍋溫度一致，分別稱取25 g樣品加至相應的三角瓶中，處理5 min后迅速冰浴冷卻，20℃ 200 r/min 0.5 h后通過梯度稀釋法測定活菌數。以未經水浴處理的作為對照組。

1.3 糞腸球菌加速儲存穩定性試驗

將加入最佳保護劑配方的糞腸球菌樣品置于不同溫度下儲存，按照試驗設計(見表2)中的時間取樣測定活菌數。

表2 加速儲存穩定性試驗分組Table 2 The experimental design for the accelerated storage test

以40、50、60℃下樣品的殘余菌數的對數值為縱坐標，放置時間為橫坐標作圖，得到該糞腸球菌樣品的模擬一級熱降解圖，由此得到對應溫度下樣品的熱降解速率K。以熱降解速度K的對數值為縱坐標，溫度(絕對溫度)的倒數為橫坐標作圖，得到一元線性回歸方程，繼而推算出某一溫度下的熱降解速率常數，結合一級反應動力學方程推導出該溫度下貯存一段時間后的殘余菌數。為驗證方程的有效性，將添加保護劑的糞腸球菌固態發酵樣品于25℃貯藏，分別于15、30、45天取樣測定活菌數以驗證方程的有效性。

2 結果與討論

2.1 糞腸球菌耐熱型保護劑的篩選

本研究選用脫脂奶粉、海藻糖、甘油、抗壞血酸鈉4種保護劑，根據參考文獻常見添加水平設計正交試驗，結果見表3。從表3可以看出，各因素對糞腸球菌穩定性的影響水平大小為:脫脂奶粉＞抗壞血酸鈉＞海藻糖＞甘油，最佳組合為A1B2C2D2，即抗壞血酸鈉 10 g/kg、海藻糖 30 g/kg、甘油 40 g/kg、脫脂奶粉80 g/kg。經驗證，60℃水浴處理5 min后平均存活率為75%(3個平行存活率分別為71%，76.74%，78%)，與未添加保護劑的對照組(3個平行存活率分別為51.92%，49%，46.29%)相比差異極顯著(P=0.000 6＜0.01)。

表3 糞腸球菌耐熱型保護劑篩選正交試驗結果Table 3 Results of the orthogonal experiment for protectants screen of E.faecalis

目前可作為微生物保護劑的物質通常包括脫脂奶粉、明膠、蔗糖、海藻糖、甘油、谷氨酸鈉等。研究表明，脫脂奶粉中的乳清蛋白尤其是酪蛋白在干燥時，可以在菌體表面形成一層蛋白膜，對細胞加以保護。而抗壞血酸鈉則作為水溶性強抗氧化劑，減少菌體在干燥或貯存過程中環境中氧氣對菌體的影響［13］。甘油作為一種可滲透至細胞內部的保護劑，通過進入細胞內部，維持細胞內外滲透壓平衡，從而減輕細胞由于溫度升高引起的細胞損傷。在多種保護劑的共同作用下，菌體在干燥及保存過程中受外界不良環境的影響降低。孫盈等人對混合乳酸菌的最佳耐熱凍干保護劑進行了研究，確定其最佳凍干保護劑配方為脫脂奶粉10%、聚乙烯吡咯烷酮5%、海藻糖5%、VC0.5%，凍干存活率預測值可達93.05%［9］。

2.2 糞腸球菌加速儲存穩定性試驗

低溫留樣觀察是測定產品儲存穩定性的一種重要方法，但儲存時間往往較長，可通過加速儲存穩定性試驗來對產品的穩定性進行初步研究。按照1.3中的試驗方法進行試驗，以儲存一段時間后的菌數N的對數值為縱坐標，儲存時間為橫坐標作圖，結果見圖1。從圖1可以看出，添加保護劑的糞腸球菌固態發酵樣品在40，50，60℃的熱降解速度 K分別為-0.002，-0.009，-0.061。

圖1 糞腸球菌殘余菌數與貯藏溫度和時間的關系圖Fig.1 Graphic correlation between survival of E.faecalis and the time at different temperature

以添加保護劑的糞腸球菌固態發酵樣品在40，50，60℃的熱降解速度K的對數值為縱坐標，溫度(絕對溫度)的倒數為橫坐標作圖(見圖2)，得到一元線性回歸方程:lgK=-7 730/T+21.95，通過該方程可計算出25℃下糞腸球菌固態發酵樣品的熱降解速率常數為-1.06×10-4，4℃熱降解速率常數為-1.15×10-6。張英華等［12］對加入冷凍干燥保護劑的乳酸菌進行了加速儲存穩定性研究，通過方程推導出4℃的熱降解速率為-1.656×10-4，本研究中糞腸球菌4℃的熱降解速率約為其1/100，具有更好的熱穩定性。

圖2 糞腸球菌熱降解速率與溫度的關系圖Fig.2 The correlation between the thermal degradation rate and temperature of Enterococcus faecalis

為驗證方程的有效性，將添加保護劑的糞腸球菌固態發酵樣品于25℃分別貯存15，30，45 d并測定殘余活菌數，與預測結果進行比較，結果見表4。從表4可以看出，貯存15，30天的實際結果與預測結果極為接近，精確率接近100%，貯存45天的實際結果與預測結果相比，精確率達到為90.6%，因此可用該方程來預測某一溫度下儲藏一定時間之后樣品的殘余菌數。

表4 25℃下儲存穩定性方程有效性驗證結果Table 4 The results of validity verification for the storage stability equation at 25℃

3 結論

通過正交試驗優化結果，確定糞腸球菌耐熱型保護劑配方為:抗壞血酸鈉10 g/kg、海藻糖30 g/kg、甘油40 g/kg、脫脂奶粉80 g/kg。加入該保護劑的糞腸球菌樣品經60℃處理5 min后平均存活率為75%，與未添加保護劑的對照組相比差異極顯著(P＜0.01)。分別于40，50，60℃對添加保護劑的糞腸球菌樣品進行加速儲存試驗，并建立了儲存穩定性方程:lgK=-7 730/T+21.95，根據該方程可知糞腸球菌25℃熱降解速率為-1.06×10-4。將樣品于25℃分別貯存15，30，45 d，測定殘余活菌數，并與預測理論值比較，接近程度在90%以上，驗證了方程的有效性。

［1］ 丁嵐峰，時勝遠.賜美健SF68在飼料業中的應用［J］.黑龍江畜牧獸醫，1998(12):17-18.

［2］ 李毅，王國良，趙海明，等.糞腸球菌優C100在肉雞生產中的應用效果試驗［J］中國畜牧業，2013(23):54-55.

［3］ 劉文彬，馬秋剛，鄧程君，等.微囊包被處理屎腸球菌制粒耐受性的評價［J］中國農業科學2012，45(6):1 169-1 175.

［4］ 鐘啟平，楊林海.高密度糞腸球菌及其發酵培養工藝［P］.中國:102286417A，2011-12-21.

［5］ Yordanova A，Stoimenova E，Donev T.Prediction of the preservation of freeze-dried cucumber mosaic virus［J］.Biotechnology Letters，2000，22(22):1 779-1 782.

［6］ Koshelev A V，Nestorov A.In express test for predicting the survival of freeze-dried methanotrophous bacterial cul-tures［J］.Mikrobiologia，1987(56):492-496.

［7］ 駱承庠，呂加平.乳酸菌發酵劑凍干保護劑篩選及應用的研究［J］.東北農業大學學報，1998，29(4):371-379.

［8］ 蘇萍，董英，程新，等.植物乳桿菌凍干保護劑的優化及其保護機制［J］.中國食品學報，2014，14(11):56-63.

［9］ 孫盈，黃金海，李瑩，等.耐熱型復合乳酸菌凍干保護劑的研究［J］.中國乳品工業，2011，39(4):12-15.

［10］ 胥振國，蔡玉華，向敏，等.凍干高活力納豆芽胞桿菌菌粉保護劑的篩選和優化［J］.微生物學通報，2013，40(5):822-828.

［11］ 徐麗萍.嗜酸乳桿菌凍干菌粉保護劑選擇的研究［J］.食品工業科技，2007(5):119-122.

［12］ 張英華，霍貴成，郭鸰.乳酸菌冷凍干燥保護劑的篩選及加速儲存穩定性試驗［J］.中國乳品工業，2007，35(2):8-10.

［13］ WANG W.Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals［J］.International Journal of Pharmaceutics，2000，203(1-2):1-60.