類芽孢桿菌發酵液提取凝乳酶方法研究*

杭鋒，王欽博，劉沛毅，洪青，齊曉彥，劉振民，陳衛

1(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

2(乳業生物技術國家重點實驗室，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海，200436)

凝乳酶是干酪生產過程中起凝乳作用的關鍵性酶，通過水解k-酪蛋白中的Phe105-Met106肽鍵導致牛乳凝結［1］。近年來有關凝乳酶的來源、凝乳機理及小牛皺胃酶替代物均有較詳細的報道研究［2-3］。隨著世界干酪產業規模的不斷擴大和小牛皺胃酶的短缺，微生物來源凝乳酶因其產量大、成本較低、經濟效益高的優勢越來越廣泛地應用于工業化生產中［4-8］。目前相關微生物產凝乳酶及其提純研究報道多集中在 Rhizomucor spp.、Mucor spp.、Aspergillus spp.和Bacillus spp.等［9-12］，而有關Paenibacillus spp.凝乳酶及多糖類物質對提取工藝的影響等方面研究鮮有報道。

前期試驗發現，Paenibacillus sp.BD3526除了擁有很高的凝乳酶生產能力外，同時其胞外多糖合成能力也很強。由于發酵液中的多糖類大分子物質在鹽析及有機溶劑沉淀過程中，易伴隨蛋白質沉淀析出，導致沉淀物中多糖含量較高、黏度較大，為后續凝乳酶的分離純化帶來一定的困難。此外通過研究發現，高通氧環境有利于微生物胞外多糖這類生物大分子的合成［13］。本文對 Paenibacillus sp.BD3526發酵過程進行研究，通過改變搖床轉速、接種量以及發酵時間，最大程度地降低發酵上清液中的多糖含量，并利用該胞外多糖和凝乳酶在不同硫酸銨飽和度下溶解性的細微差異，實現凝乳酶較高的回收率，為后期的分離純化、酶學性質研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Paenibacillus sp.BD3526(CGMCC No.8333=DSM No.28815)，從西藏羌塘草原牧民牦牛乳中分離。

1.1.2 主要儀器和試劑

凍干機12L型，Labconco公司;恒溫搖床HZQX500C，上海一恒科學儀器公司;離心機 D-37520，Kendro公司;黏度計R180型，ProRheo公司;分光光度計Specord205，Analytik Jena公司;小牛皺胃酶，上海阿敏生物公司;Rhizomucor miehei凝乳酶Marzyme? 150 MG，美國杜邦丹尼斯克公司;Aspergillus niger var.awamori重組凝乳酶Chy-Max?，丹麥Chris Hansen公司;脫脂奶粉，Fonterra公司;葡萄糖標準樣品為色譜分析純;小麥麩皮(蛋白質 18.6%，脂肪6.20%，總碳水化合物63.9%，水分7.89%，灰分3.38%)購于農貿市場;其余試劑及培養基均為國產分析純，購于國藥集團。

1.2 培養基及培養方法

麩皮培養基:小麥麩皮質量百分含量為2%，余量為水，裝樣量50 mL于，121℃滅菌20 min后，待用。

TYC液體培養基:稱取酪朊水解物(或胰胨)15.0 g，酵母膏5.0 g，L-胱氨酸0.2 g，乙酸鈉20.0 g，Na2SO40.1 g，NaCl 1.0 g，NaHPO4·12H2O 2.0 g，NaHCO32.0 g，蔗糖50.0 g，溶解于1 L蒸餾水中，調節pH7.3，121℃滅菌20 min，待用。

1.3 BD3526麩皮發酵上清液制備

將類芽孢桿菌BD3526接種于無菌TYC液體培養基中，30℃、180 r/min搖床培養20 h后，作為種子液(約5×108CFU/mL);將種子液按2%(v/v)接種于滅菌后的麩皮培養基，30℃、180 r/min搖床培養48 h后，于4℃、15 000 g離心15 min收集發酵上清液。

1.4 樣品凝乳酶活力測定

凝乳酶活力測定方法參照Van等人的方法并做適當調整［14］。將脫脂奶粉以 1∶10(g∶mL)的比例配置成pH 6.0含有0.01 mol/L CaCl2的溶液，在35℃水浴中孵育10 min，分別加入500 μL稀釋酶液，每5 s將樣品取出并傾斜45°觀察樣品組織狀態，以形成不連續顆粒的時間計作凝乳時間。按公式(1)計算樣品中凝乳酶活力(SU/mL)，按公式(2)計算其酶活回收率RE(%)。

式中，T—凝乳時間，s;VS—脫脂乳體積，mL;VE—酶液體積，mL;D—稀釋倍率。

式中，MCA1—發酵液上清酶活，SU/mL;V1—發酵液上清體積，mL;MCA2—硫酸銨沉淀溶解后樣品酶活，SU/mL;V2—硫酸銨沉淀溶解后樣品體積，mL。

1.5 樣品總糖含量測定

參照Taylor［15］苯酚硫酸法測樣品糖含量，并做部分調整。葡萄糖標準曲線的制作:配制1 mg/mL的葡萄糖溶液，分別吸取 0、2、5、10、50 及 100 μL 葡萄糖標準液，以蒸餾水補至200 μL，加入5%苯酚0.4 mL和濃硫酸2 mL，搖勻，室溫放置20 min后于490 nm測吸光值，得標準曲線 y=0.002x+0.043，R2=0.9984(橫坐標為糖濃度)。

樣品糖含量的測定:分別吸取稀釋后的樣品200 μL，加入5%苯酚0.4 mL及2 mL濃硫酸，搖勻，室溫放置20 min后于490 nm測吸光值，以200 μL蒸餾水作為空白，依據標準曲線分別測定發酵上清液和硫酸銨沉淀后溶液糖含量(mg/mL)。

糖含量回收率RP按公式(3)計算:

式中，C1—發酵上清液糖濃度，mg/mL;V1—發酵液上清體積，mL;C2—硫酸銨沉淀復溶樣品糖濃度，mg/mL;V2—硫酸銨沉淀復溶樣品體積，mL。

1.6 樣品黏度的測定

使用proRheo-R180型黏度計，調節轉速1 000 r/min，操作環境溫度10℃，分別取少量樣品溶液倒入樣品槽內，轉子旋轉10 s后度數即為黏度值(mPa·s)。

1.7 BD3526產凝乳酶條件優化

1.7.1 不同培養時間對發酵上清液的影響

將種子液按2%(v/v)接種于滅菌后的麩皮培養基，30 ℃、180 r/min 搖床培養12、24、48、72、84 h 后，取BD3526麩皮發酵液，于4℃、15 000 g離心15 min收集上清發酵液，并分別測定發酵液上清液凝乳酶活性、糖含量及黏度值。

1.7.2 不同搖床轉速對發酵上清液的影響

將種子液按2%(v/v)接種于滅菌后的麩皮培養基，分別在140、160、170、180、300 r/min，30 ℃搖床培養48 h后，取BD3526麩皮發酵液，于4℃、15 000 g離心15 min收集上清發酵液，并分別測定發酵液上清液凝乳酶活性、糖含量及黏度值。

1.7.3 不同接種量對發酵上清液的影響

將種子液分別按體積分數為0.4%、0.8%、1.6%、2.0%、2.4%、3.2%接種于麩皮培養基，30℃、180 r/min搖床培養48 h后，于4℃、15 000 g離心15 min收集上清發酵液，并分別測定發酵液上清液凝乳酶活性、糖含量及黏度值。

1.8 粗凝乳酶提取方法

按“1.7發酵BD3526產凝乳酶條件優化”后的試驗方法，收集并測量發酵上清液的總體積，在具有機械攪拌的情況下，將硫酸銨粉末緩慢加入發酵上清液中溶解，分別加至硫酸銨的濃度達到飽和度(25℃)為 50%、55%、60%、65%、70%、75% 和80%，4℃靜置2 h后，于4℃、15 000 g離心15 min，收集沉淀物，使用0.02 mol/L PBS對沉淀進行溶解，于4℃、15 000 g離心15 min條件下去除不溶物質，收集并測量離心上清液的MCA和體積。將沉淀上清液凍干得到BD3526凝乳酶的粗提物。

1.9 凝乳酶活力的對比

分別取60%硫酸銨沉淀凍干后粗提物及商業化凝乳酶chymosin、小牛皺胃酶、R.miehei凝乳酶各5 mg，使用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)溶解至10 mL，按“1.4樣品凝乳酶活力測定”方法，比較不同樣品之間凝乳酶活力差異。

1.10 數據分析

所有實驗均重復3次，實驗數據均用平均值±標準偏差(SD)表示，并使用SAS 9.2軟件進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 培養時間對發酵上清液的影響

發酵時間對發酵上清液中的凝乳酶活力、糖含量和黏度的影響如圖1所示。培養12～24 h時，發酵上清液中凝乳酶酶活力呈較高水平，24 h時凝乳酶活力最高達到(3 209.09±85.64)SU/mL，這與微生物蛋白酶主要在對數生長后期或穩定期積累的報道相一致［16］;發酵培養至72 h時，發酵液中凝乳酶活力仍維持較高水平為(2 545.67±57.34)SU/mL，此時黏度及糖含量均顯著下降(P＜0.01);發酵84 h后，凝乳酶活力較低僅為(1 814.52±21.38)SU/mL。

圖1 發酵時間對發酵上清液凝乳酶活力、糖含量和黏度的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the milk-clotting activity，exopolysaccharides content and viscosity in the supernatant

發酵上清液中的糖含量及黏度值隨發酵時間的變化趨勢與凝乳酶活力一致，均隨著時間的延長呈下降趨勢。24 h時糖含量和上清液黏度值最高，分別為(5.29±0.57)mg/mL和(15±1)mPa·s;發酵72 h后，糖含量和黏度值變化顯著，均維持在較低水平，分別為(2.24±0.62)mg/mL和(9±1)mPa·s。該結果與 Thiry［17］、Wernersson［18］和 Calik［19］的報道研究相似，通過延長培養時間，可以有效降低培養液內多糖含量，減小發酵液的黏度，原因可能是隨著發酵時間的延長，菌種對多糖類物質的進行了消耗。因此，選擇發酵時間為72 h，不僅其凝乳酶活力維持較高水平，且其糖含量及黏度值均較低。

2.2 搖床轉速對發酵上清液的影響

在接種量為2%(v/v)，培養溫度為30℃的情況下，搖床轉速(140～300 r/min)對發酵上清液的影響如圖2所示。

圖2 搖床轉速對發酵上清凝乳酶活力、糖含量和黏度的影響Fig.2 Effect of shaking speed on the milk-clotting activity，exopolysaccharides content and viscosity in the supernatant

由圖2可知，隨著轉速的增加，發酵上清液的凝乳酶活、糖含量以及黏度值均有不同程度的提高。轉速在140～160 r/min時，凝乳酶活力增加較快，糖含量和黏度值較低;當轉速超過160 r/min后，凝乳酶活力變化不大，糖含量緩慢上升，且黏度顯著提高(P＜0.01)。轉速達到300 r/min時，發酵上清液中糖含量較高為(3.71±0.55)mg/mL，黏度為(14±1)mPa·s。原因是搖瓶培養中的氧傳遞系數(KLa)隨著裝液量的增加而降低、轉速的提高而增加［20］。搖床轉速過快，提高了培養基中溶解氧含量，可能促進了大分子糖類物質的產生［21-22］。在160 r/min時，其凝乳酶活力為(2 449.25±49.88)SU/mL，且發酵液中糖含量(2.51±0.23 mg/mL)和黏度(8±1 mPa·s)均維持較低的水平，因此，選擇該轉速作為進一步優化的培養條件。

2.3 接種量對發酵上清液的影響

在培養溫度為30℃、搖床轉速為160 r/min的條件下，接種量(0.4% ～3.2%)對發酵上清液的影響如圖3所示。由圖3可知，當接種量在1.6%(v/v)時，發酵液中凝乳酶活力達到最大值;而發酵上清液的糖含量與接種量呈正相關，當接種量超過1.6%時，糖含量明顯增加，接種量為3.2%時，糖含量為最高(3.59±0.31)mg/mL;黏度值亦隨接種量的增大而逐漸增大，在0.4%和0.8%的接種量下，黏度值較低，且均為(8±1)mPa·s，接種量超過1.6%時黏度值均高于(10±1)mPa·s。接種量的不同造成發酵上清液中糖含量和黏度發生顯著變化，原因可能是TYC種子液中帶入的蔗糖促進了多糖的合成，使得發酵上清液中多糖積累量增多。因此，選擇0.8%(v/v)的接種量，在此條件下，發酵上清中凝乳酶活力可以達到(2 685.71±34.78)SU/mL，而糖含量和黏度均保持在較低水平。

圖3 接種量對發酵上清液中凝乳酶活力、糖含量和黏度的影響Fig.3 Effect of inoculum size on the milk-clotting activity，exopolysaccharides content and viscosity in the supernatant

2.4 優化后發酵工藝驗證

按照單因素實驗結果，選擇接種量體積分數為0.8%、搖床轉速為160 r/min、發酵時間為72 h，其余步驟參照“1.3 BD3526麩皮發酵及制備”操作，比較優化前后凝乳酶活力、糖含量及黏度值差異，結果如表1所示。

由表1可知，通過優化發酵過程中的接種量、搖床轉速以及發酵時間等因素，能獲得較高酶活(2 685.71±35.35 SU/mL);糖含量相對優化前降低了52.32%，有效降低發酵液中的多糖含量;黏度也較優化前(接種量體積分數為2%)，搖床轉速180 r/min，發酵時間48 h)有了明顯的降低。因此通過發酵條件的優化，可有效減少糖類對后續分離純化的干擾影響。

表1 優化前后BD3526上清液發酵液結果比較Table 1 Comparison of the milk-clotting activity，exopolysaccharides content and viscosity in the supernatant before and after the optimization

2.5 硫酸銨飽和度對凝乳酶提取效果的影響

分別使用50%～80%飽和度的硫酸銨對優化發酵條件制備的發酵上清液中的凝乳酶進行鹽析沉淀，并分別測定不同飽和度硫酸銨條件下，凝乳酶活力和糖含量的回收率，以篩選出硫酸銨提取凝乳酶較佳的飽和度。實驗結果如表2所示。

表2 不同飽和度硫酸銨對發酵上清液中凝乳酶和多糖沉淀效果Table 2 Effect of ammonium sulfate saturation on the recoveries of milk-clotting enzyme and exopolysaccharidesin the supernatant

由表2可知，隨著硫酸銨飽和度不斷升高(50%～60%)，其凝乳酶回收率也不斷增大，當加入硫酸銨飽和濃度超過65%時，多糖伴隨凝乳酶大量沉淀，導致其凝乳酶回收率逐漸降低，這有可能是發酵體系中的多糖具有懸浮和穩定作用所致;而沉淀物的糖含量回收率則與硫酸銨飽和度呈正相關，沉淀中的糖含量隨硫酸銨飽和度的增大也不斷變大，當硫酸銨飽和濃度超過60%，沉淀中糖含量回收率增加較快。

目前對發酵上清液的目的蛋白的提取方法較常用的有鹽析法(硫酸銨等)和有機溶劑沉淀法(乙醇、丙酮等)等，本實驗前期采用乙醇沉淀方法(乙醇與發酵液的體積比為3∶1)可實現37.52% ±5.89%的回收率，但多糖的回收率達到了80%以上。本文利用60%硫酸銨沉淀法獲得了凝乳酶粗提物，其酶活回收率最高為32.08%，糖類物質的回收率也僅為16.76%，有效避免了糖類物質的大量沉淀，實現了BD3526凝乳酶和多糖的有效分離。

通過發酵條件及提取方法的優化，將凍干所得的粗凝乳酶與目前商業化用酶進行比較(表3)。結果發現，優化后的樣品凝乳酶活力為(188.45±5.71)SU/mg，雖然較Hansen、Danisco等商業化凝乳酶活力低，但高于商業化小牛皺胃酶的酶活，達到了商業化應用的水平。因而，優化BD3526的發酵條件及提取方式，獲得較低糖含量的粗凝乳酶，對于后期酶的分離純化和酶學性質研究具有重要意義。

表3 BD3526與商業化凝乳酶活力的對比Table 3 Comparison of milk-clotting activity between commercial coagulants and BD3526 MCE

3 結論

本文對Paenibacillus spp.BD3526發酵小麥麩皮生產凝乳酶發酵條件進行了優化，在保證凝乳酶活力未明顯降低的前提下，通過對培養過程中的搖床轉速、接種量以及發酵時間的改變，降低發酵上清液中的多糖類含量和黏度值。在此基礎上，選用合適飽和度的硫酸銨進一步實現對凝乳酶和多糖進行分離。結論如下:

(1)當接種量體積分數為0.8%、搖床轉速為160 r/min、發酵時間為72 h時，發酵上清液中的糖和黏度均降低到了最低值，分別為1.33 mg/mL和8 mPa·s，而上清液凝乳酶活力未顯著降低。在保證酶活力及其回收率的前提下，有效降低了發酵上清液中多糖的含量。

(2)利用該菌株胞外多糖和凝乳酶在不同硫酸銨飽和度下的溶解性差異，選擇了飽和度60%的硫酸銨提取發酵液中的凝乳酶可實現了較高的酶活回收率，制備的凝乳酶粗提物，其凝乳酶活力為(188.45±5.71)SU/mg，達到了商業化應用的水平。

(3)優化后所得的凝乳酶粗提物，糖含量少，粗酶黏度較低，便于后續凝乳酶的進一步分離和純化。

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