大黃素對食品模型中晚期糖基化終產物的抑制作用

劉玲，康世墨，張瑩，岳璐

(沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽，110866)

美拉德反應是一種廣泛存在于食品加工貯藏等過程中的非酶糖基化反應，也稱為“非酶褐變”或“羰氨反應”［1］。美拉德反應在高溫、室溫下均可發生，它不僅與食品的色香味及營養、安全等方面有關，更與人體健康密切相關。食品在進行焙烤、油炸等加工時，美拉德反應末期引發蛋白質交聯，生成晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)［2］。研究表明，內源性 AGEs具有體內積聚性，已被證實與許多疾病發生有關，如與糖尿病、動脈硬化等［3］。食源性AGEs是人體AGEs的主要來源，每天AGEs的攝入量大約是25～75 mg，是尿毒癥病人血液濃度的10～15倍，只有1/3的食源性AGEs可通過腎臟排出體外，剩余2/3保留在體內，其中大約有1/10參與血液循環［4］。目前對抑制AGEs生成的研究主要集中在醫學領域，常用的AGEs抑制劑為氨基胍、ALT 711(4，5-二甲基-3-苯乙酰基噻唑嗡氯化物，DPTC)，但臨床試驗表明它們對人體具有較大副作用［5］。因此，天然抑制劑的研發已受到科研人員的廣泛關注。有相關研究表明，許多具有天然生物活性的多酚類物質，如吡哆胺、黃酮類、楊梅素等可有效抑制體內外AGEs的生成［6-8］。酚類很容易被氧化成醌類，醌類物質亦可以作為AGEs抑制劑，2011年Hiba等［9］人的研究表明，百里香醌對人體內外的AGEs具有很好的抑制作用。

大黃素(1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌)是從天然蘆薈、大黃等植物中提取出來的一種蒽醌類活性物質，具有典型的9，10-蒽醌結構，處于最高氧化水平，較為穩定。醫學研究表明，大黃素具有抗癌、抗腫瘤、抗炎、抑菌、抗病毒、抗腦缺血損傷、抗氧化、瀉下等作用［10］。YAN 等［11］探討了大黃素對草魚肝細胞的抗氧化作用，并且具有清除自由基的作用。這些研究主要在醫學領域，其對于食品加工過程中糖基化反應的抑制作用未見深入報道。

本文建立賴氨酸-葡萄糖模擬反應體系，以大黃素作為天然抑制劑，通過對糖基化模型體系反應早期、中期和末期各個階段的產物變化進行分析，探究大黃素對AGEs形成的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-賴氨酸(L-Lys)、葡萄糖(Glc)、NaH2PO4、Na2HPO4、硝基四氮唑藍(NBT)、鹽酸羥胺、乙酸鈉、冰乙酸均為分析純，甲醇、甲酸均為色譜純，大黃素(98%)購于西安天豐生物科技有限公司。實驗用水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;F-4600熒光分光光度計，日本日立公司;D-2000 Elite制備型液相色譜儀，日本Hitachi公司;Prominence LC-20AB高效液相色譜儀，美國惠普公司;DK-S26電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司;00000249精密電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立Lys-Glc模擬反應體系

將用PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)溶解的摩爾濃度比為3∶1的Lys溶液和Glc溶液各取1 mL于具塞試管中，搖勻后，加入同樣用PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)溶解的20 μmol/L的大黃素溶液1 mL，搖勻并置于70℃的恒溫培養箱中培養，以不加抑制劑組作為空白對照。

1.3.2 果糖胺的測定

利用NBT還原法測定果糖胺，用碳酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 10.83)配制0.025 mol/L的NBT(硝基四氮唑藍)試液。取各組樣品溶液1 mL，加入NBT試液4 mL，10%的醋酸溶液終止反應，在530 nm處測其紫外吸光值，不加抑制劑組為對照組，測定0～12 h反應的吸光值。

1.3.3 GO的測定

取各組反應樣液0.5 mL于50 mL容量瓶中，加入乙酸鈉溶液(15 g/L)1 mL、鹽酸羥胺溶液(2 g/L)2 mL，于50℃恒溫水浴中加熱20 min，冷卻后定容，在233 nm處測其紫外吸光值，不加抑制劑組為對照組，測定0～12 h反應的吸光值。

1.3.4 CML的測定

反應樣液經0.45 μm濾膜過濾，取20 μL進樣，用峰高表示CML含量。

液相條件:色譜柱:Waters Atlantis T3 C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:V(0.1%甲酸)∶V(甲醇)=70∶30;流動相流速:0.5 mL/min;柱溫:25℃;進樣量:20 μL;運行時間 10 min。

1.3.5 5-HMF的測定

取各組反應樣液0.2 mL于試管中，用PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)稀釋至無色后，在284 nm處測其紫外吸光值，不加抑制劑組為對照組，測定0～12 h反應的吸光值。

1.3.6 類黑精的測定

取各組反應樣液0.2 mL于試管中，用PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)稀釋至無色后，在420 nm處測其紫外吸光值，不加抑制劑組為對照組，測定0～12 h反應的吸光值。

1.3.7 戊糖素的測定

戊糖素具有熒光特性，取各組反應樣液0.2 mL于試管中，用PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)稀釋至無色后，在在激發波長335 nm、發射波長382 nm處測定其熒光強度，以熒光強度表示AGEs含量，不加抑制劑組為對照組，測定0～6 h反應的熒光強度。

1.3.8 熒光性AGEs的測定

利用AGEs具有熒光性的特性，在激發波長370 nm、發射波長440 nm處有最大吸收峰，取各組反應樣液0.2 mL于試管中，用PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)稀釋至無色后，測定其熒光強度，以熒光強度表示AGEs含量，不加抑制劑組為對照組，測定0～12 h反應的熒光強度。

1.3.9 數據處理

采用SPSS17.0軟件處理數據，以Origin8.0軟件繪圖。顯著性分析，P＜0.01極顯著;P＜0.05顯著，試驗均進行3次重復。

2 結果與分析

2.1 大黃素對果糖胺生成的抑制作用

果糖胺是美拉德反應初期經羰氨縮合生成的席夫堿再經環化后生成的胺糖。由圖1可知，反應1～4 h為果糖胺的大量生成期，在此期間果糖胺的含量隨反應時間的延長而增加;4～10 h果糖胺逐步緩慢生成，這是因為部分果糖胺參與到中期反應生成二羰基化合物。加入大黃素后，對早期產物果糖胺的生成起到抑制作用，在反應6h時，抑制率最大，達到26.14%(P ＜0.05)。

圖1 大黃素對Lys-Glc體系中果糖胺含量變化的影響Fig.1 Effect of emodin on the content changes of fructosamine in Lys-Glc system

2.2 大黃素對GO生成的抑制作用

GO為非酶糖基化反應的初中期產物，是一種簡單的二羰基化合物，利用醛基成肟反應生成的乙二醛二肟的生成量變化反映出GO的含量變化。由圖2可知，反應1～6 h GO緩慢生成，在此期間GO的含量隨反應時間的延長緩慢增加;6 h后GO大量生成，這是由于一方面果糖胺的參與促進二羰基化合物的大量生成［12］;另一方面，底物葡萄糖自氧化也能夠生成GO，所以GO在此階段大量生成［13］。加入大黃素后，對GO的形成有明顯的抑制作用，在反應10 h時，抑制率達到72.22%(P＜0.01)。

圖2 大黃素對Lys-Glc體系中乙二醛含量變化的影響Fig.2 Effect ofemodin on the content changes of glyoxal in Lys-Glc system

2.3 大黃素對CML生成的抑制作用

由圖3可知，反應1～6 h CML緩慢生成，此階段主要進行糖基化的初、中期反應，生成大量果糖胺及少量 GO;反應6～10 hCML大量產生，GO參與了CML的生成，CML的產生隨GO的增加而顯著上升;10 h之后CML含量減少，美拉德反應進入大分子黑色素生成的聚合反應階段。大黃素對CML的生成有明顯的抑制作用，尤其反應中后期CML大量生成，反應10 h時抑制率達到95%(P＜0.01)。

圖3 大黃素對Lys-Glc體系中CML含量變化的影響Fig.3 Effect of emodin on the content changes of CML in Lys-Glc system

2.4 大黃素對5-HMF生成的抑制作用

5-HMF是美拉德反應中期Amadori重排產物經烯醇化后脫水形成的醛類化合物，為中期產物生成的另一種途徑。由圖4可知，5-HMF的生成隨反應時間的延長而增大，到4 h后不再增加。大黃素對5-HMF僅在4 h附近有較小的抑制作用。

2.5 大黃素對類黑精生成的抑制作用

類黑精是美拉德反應中期產物與含氮氨基化合物進行醛氨聚合而產生的末期產物，黑褐色，無熒光性。由圖5可知，類黑精的生成量隨反應時間的延長先緩慢增長，4 h后快速增長，直到反應10 h后開始減少。加入大黃素后，對類黑精有明顯的抑制作用，特別是反應6 h時抑制率達68%(P＜0.01)。

圖4 大黃素對Lys-Glc體系中5-羥甲基糠醛含量變化的影響Fig.4 Effect of emodin on the content changes of 5-HMF in Lys-Glc system

圖5 大黃素對Lys-Glc體系中類黑精含量變化的影響Fig.5 Effect of emodin on the content changes of melanoidions in Lys-Glc system

2.6 大黃素對戊糖素生成的抑制作用

戊糖素是Amadori重排產物經過脫氫、重排、交聯等一系列反應，最終生成一種具有熒光性的糖基化終末產物之一。由圖6可知，戊糖素的含量隨反應時間的延長先增大后減小，最后趨于不變。大黃素自身具有熒光性，但熒光值較低。體系加入大黃素后，對戊糖素沒有明顯抑制作用，但延緩了戊糖素的生成。

圖6 大黃素對Lys-Glc體系中戊糖素含量變化的影響Fig.6 Effect of emodin on the content changes of pentosidine in Lys-Glc system

2.7 大黃素對熒光性AGEs生成的抑制作用

AGEs是一種結構多樣的化合物，其中部分AGEs具有熒光性。由圖7可知，熒光性AGEs的生成量隨反應時間的延長先增后減。加入大黃素后，對反應0～3 h的熒光性AGEs具有明顯的抑制作用，特別是反應2 h時，達到最大抑制率為90%(P＜0.01);當反應4 h后，熒光值升高，說明大黃素不再抑制熒光性反應，可見大黃素對戊糖素等熒光性物質的延遲作用，也體現出大黃素對熒光性產物的延遲作用。

圖7 大黃素對Lys-Glc體系中熒光性AGEs含量變化的影響Fig.7 Effect of emodin on the content changes of fluorescent AGEs in Lys-Glc system

3 討論

對于含糖和蛋白的食品，在加工過程中能夠生成糖基化產物。加工過程常在高溫下進行，由于溫度過高導致反應速度過快，常常不利于觀察反應各階段產物的變化，故本研究將模擬體系溫度設定為70℃。

大黃素作為一種天然抑制劑添加到非酶糖基化模擬體系中，在反應初期階段，大黃素對由葡萄糖羰基與賴氨酸氨基縮合環化生成的果糖胺具有抑制作用。果糖胺經Amadori重排后，經烯醇化后再裂解成為二羰基化合物(包括GO、MGO、3-DG、乙二酸等)，進入非酶糖基化的中期階段，大黃素對GO表現出明顯的抑制作用。反應后期，二羰基化合物與氨基化合物醛氨聚合生成末期產物，大黃素對這些產物包括CML、類黑精都有較好的抑制作用。在反應過程中，GO作為CML的前體物質，可經葡萄糖自氧化生成，也可經美拉德反應中間產物氧化生成，因此大黃素抑制糖基化的作用主要體現在抗氧化作用上。大黃素對美拉德反應中間產物5-HMF的生成無明顯抑制作用，也說明了大黃素抑制糖基化作用主要表現在抗氧化作用上。大黃素對戊糖素無明顯抑制作用，這一結果與梁海燕等人的研究結果相似［14］，可能是由于戊糖素的生成路徑與CML有所不同。

4 結論

本研究建立了Lys-Glc模擬食品加工過程中的非酶糖基化反應體系，通過對果糖胺、GO、CML、5-HMF、類黑精、戊糖素、熒光性AGEs的含量變化分析，明確大黃素對非酶糖基化反應的抑制作用。結果表明，大黃素對糖基化反應的氧化產物及進一步生成的中、末期產物具有較好的抑制作用，對具有熒光性的糖基化產物戊糖素和其他熒光性AGEs抑制作用不明顯，大黃素的抑制作用主要體現在抗氧化性上。

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