植物乳桿菌L01對人結腸癌細胞系Caco-2的黏附性能*

吳凡，黃翠姬，劉昭明，黃群，張亞麗

(廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州，545006)

植物乳桿菌屬于腸道內微生物菌群的一種，常見于蔬菜發酵制品［1］。其作為人類消化道中的重要菌群，具有抑制病原菌，修復腸道黏膜，降低血清膽固醇，提高人體免疫力等益生功能［2-3］。乳酸菌對人體發揮益生作用與其能在消化道內定植的能力有關，而黏附則是定植的先決條件［4］。研究發現，乳酸菌對細胞的黏附是由于細胞壁中黏附素與宿主表面的受體相結合的結果，其黏附性能受到一些外在因素，如周圍環境的pH值、離子濃度、溫度以及菌體生長階段等的影響［5-6］。

近兩年來國內外的研究焦點主要集中在乳酸菌黏附力的考察和黏附機理上，王麗群［7］和李清［8］根據研究菌株的黏附能力、表面疏水性和自動聚集能力三者之間關系，來判斷菌株黏附性能的強弱。盧千慧［9］通過對乳桿菌的表面S-層蛋白的研究，深入探討了乳桿菌的黏附機理。相比之下，對乳酸菌黏附作用的過程所受到影響因素研究較少且不夠全面。對影響乳酸菌黏附過程中的因素的研究不僅有助于明確乳酸菌的黏附機理，而且為其更好地黏附于腸道創造了條件。本實驗在前人研究的基礎上，通過考察篩選自泡菜的植物乳桿菌L01黏附于Caco-2細胞的性能，研究了不同因素對其黏附效果的影響，并對其機理進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 菌株和細胞

植物乳桿菌L01，由廣西科技大學生物與化學工程學院微生物實驗室提供;人結腸癌腺細胞系Caco-2細胞株，購自南京凱基生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

MRS(Man-Rogosa-Sharpe)培養基、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培養液、0.25% 胰酶-EDTA，青島海博生物科技有限公司;類胎牛血清，上海玉博科技有限公司。其他試劑均為分析純或化學純。DMEM完全培養液由78%DMEM培養液、20%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素濃度均為100 U/mL)和1%谷氨酰胺組成，并加入1 mL的NaHCO3作為指示劑。

1.3 細菌培養

將植物乳桿菌L01置于含20%甘油的MRS中-60℃保存，將上述菌株接種于MRS液體培養基，37℃培養24 h，并活化2次。

1.4 細胞培養

采用Caco-2細胞作為腸上皮細胞模型，進行黏附性試驗。Caco-2細胞經復蘇后加入DMEM完全培養液中，放置在CO2培養箱(5%CO2和95%空氣)中，37℃培養，2 d換液1次。待細胞生長至70% ～80%貼壁，用0.25%胰酶-EDTA消化傳代，傳代5次左右，大約20天后，將細胞接種于6孔細胞培養板中，細胞濃度約為2×106CFU/cm2，待細胞長成單層進行黏附實驗。

1.5 黏附實驗

1.5.1 黏附觀察

將已經長成單層的Caco-2細胞用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.4)洗滌2次。分別向細胞板的每個孔中加入1 mL細菌懸液(1.0×108CFU/mL)，在CO2培養箱(5%CO2和95%空氣)中，37℃環境中孵育2 h。然后用無菌PBS漂洗細胞3次，除去未黏附的細菌。生長在6孔培養板中的蓋玻片經過漂洗后用0.4%多聚甲醛固定0.5 h，靜置干燥，革蘭氏染色，在細胞成像儀下觀察植物乳桿菌L01的黏附情況。

1.5.2 黏附計數

將細胞懸浮液直接滴加于六孔培養板中。經PBS洗滌后，一部分孔中加入含有200 μg/mL慶大霉素的DMEM不完全培養液2 mL，孵育1 h，之后用PBS漂洗3次，以此來殺死黏附在細胞表面的細菌，從而確定侵襲進入細胞內的細菌數。然后在所有孔中加入0.7 mL胰酶作用10 min，待細胞完全脫落，再加入0.3 mL不完全培養液終止反應。最后加入0.5 mL 0.1%TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，混勻后靜置10 min，以裂解細胞。將混合物轉移到試管中，選取合適稀釋梯度，進行平板菌落計數。做空白對照，選取長至單層的空白細胞培養板進行細胞計數。每個處理作3個平行，并按照公式(1)計算平均每個細胞黏附的細菌數。

1.6 不同因素對菌株黏附性能的影響

乳酸菌的黏附定植主要是通過黏附素和細胞上的特異性受體結合完成，此過程的發生與菌體生長階段、溫度、pH、菌濃度、黏附作用時間、金屬離子濃度以及環境中單糖種類等其他影響因素有關。

1.6.1 菌液濃度對黏附性能的影響

取培養至12 h的L01菌體，調整其濃度分別為105，106，107，108，109CFU/mL，與細胞共培養 2 h，計數黏附的細菌數。

1.6.2 生長階段對黏附性能的影響

取培養至 4，8，12，16，20 h的L01菌體，調整其濃度為1.0×108CFU/mL，與細胞共培養2 h，計數黏附的細菌數。

1.6.3 作用時間對黏附性能的影響

取培養至12 h的L01菌體，調整其濃度為1.0×108CFU/mL，與細胞共培養 0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，計數黏附的細菌數。

1.6.4 環境pH值對黏附性能的影響

取培養至12 h的L01菌體，用不同pH的緩沖液(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)調整其濃度為 1.0 ×108CFU/mL，與細胞共培養2 h，計數黏附的細菌數。

1.6.5 單糖對黏附的抑制作用

在細菌懸浮液中分別加入D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、甲基-α-D-甘露糖苷(終濃度為100 mmol/L)，與細胞共培養2 h，考察單糖對黏附的影響。

1.6.6 二價金屬離子對黏附作用的影響

在培養12 h濃度為1.0×108CFU/mL的L01菌懸液中加入 CaCl2和 MgCl2(終濃度分別為0，5，10，15，20 mmol/L)，與細胞共培養2 h，進行黏附試驗。

1.7 統計學處理

采用Origin9.1對實驗數據進行作圖。數據結果以x±s表示，采用SPSS 20.0統計軟件中的獨立樣本T檢驗進行數據分析，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05無顯著差異。

2 結果與分析

2.1 菌液濃度對黏附作用的影響

將菌液L01濃度分別調整為1×105，1×106，1×107，1 ×108，1 ×109CFU/mL，然后進行黏附實驗，實驗結果如圖1所示。

圖1 菌液濃度對L01黏附于Caco-2的影響Fig.1 The effect of different bacterial concentrations on the adherence of L.plantnum L01 on Caco-2 cells

根據T檢驗分析可知，植物乳桿菌L01對Caco-2的黏附性具有一定的濃度依賴性。當濃度從1×106CFU/mL升高至1×109CFU/mL時，Caco-2上黏附的植物乳桿菌L01菌數隨著菌液濃度的升高而顯著增加，相應值彼此間差異顯著(P＜0.05)，而當菌液濃度1×105CFU/mL升高至1×106CFU/mL時，其黏附數之間無顯著差異(P＞0.05)。當達到1×109CFU/mL時，黏附數為7.76±0.11個/細胞，此時黏附達到穩定。參考李清的研究［8］，可以推測植物乳桿菌L01與細胞Caco-2的黏附機制主要是乳桿菌表面的黏附素與細胞表面的特異性受體結合而形成黏附力。當植物乳桿菌L01濃度達到1×109CFU/mL時，此時Caco-2細胞表面的受體結合位點已經達到飽和，此時L01的黏附達到動態平衡。

2.2 生長階段對黏附作用的影響

分別取培養時間為 4，8，12，16，20 h 五個生長階段的菌液進行黏附實驗。實驗結果如圖2所示。根據T檢驗分析可知，當進行黏附實驗的菌齡低于12 h時，黏附的細菌數隨著菌齡的增長顯著增加(P＜0.05)。當細菌生長時間超過12 h，黏附的細菌數趨于飽和(P＞0.05)。細菌生長時間為16 h時，植物乳桿菌L01生長進入穩定后期。當菌齡達到20 h時，黏附的細菌數有了明顯的降低(P＜0.05)。由此可知，處于穩定期的植物乳桿菌L01對Caco-2具有更好的黏附性。由于植物乳桿菌L01在不同的生長階段，其形態結構，菌體表面成分以及代謝產物有較大的不同，因而造成不同的黏附效果。由實驗數據可知，處于穩定期的L01黏附性最穩定，這與其他研究者結果保持一致［10］?？梢酝茰y處于穩定期的細菌不管是從數量還是形態結構以及表面成分較其他生長階段都更為穩定，可能與其分泌黏附素的性質與多少有關，這就導致了植物乳桿菌L01與Caco-2細胞受體的結合更多更穩定。

圖2 生長階段對L01黏附Caco-2的影響Fig.2 The effect of different growth stage on the adherence of L.plantnum L01 on Caco-2 cells

2.3 作用時間對黏附作用的影響

將植物乳桿菌L01濃度都調整為1×108CFU/mL，使其與細胞分別 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h 共孵育后進行黏附試驗。實驗結果圖3所示。根據T檢驗分析可知，在2 h之內，隨著共孵育時間的延長，黏附細菌數有顯著增加(P＜0.01)。2 h之后，黏附的細菌數變化趨于平緩，彼此之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。植物乳桿菌L01對Caco-2的黏附作用在一定范圍內存在著時間依附性，當孵育時間達到2 h時，黏附作用達到平衡?？梢酝茰y植物乳桿菌L01與黏附作用時間存在著時間效應關系，需要一定的作用時間黏附數才能達到動態平衡。隨著黏附作用時間的延長，黏附的細菌數隨之增加，2 h達到黏附飽和。表明此時Caco-2細胞表面的黏附素受體數量已經達到飽和，黏附數趨于穩定。

圖3 不同作用時間對L01黏附于Caco-2的影響Fig.3 The effect of different incubating times on the adherence of L.plantnum L01 on Caco-2 cells

2.4 環境pH對黏附作用的影響

用 pH 分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 的緩沖液將植物乳桿菌濃度調整為1×108CFU/mL后進行黏附實驗，實驗結果圖4所示。

圖4 pH對L01黏附于Caco-2的影響Fig.4 The effect of different environmental pH on the adherence of L.plantnum L01 on Caco-2 cells

根據T檢驗分析可知，當培養環境pH處于3～6之間時，隨著pH的升高黏附的細菌數有顯著的增加(P＜0.01);當培養環境pH達到6.0之后，黏附的細菌數趨于飽和，并且在培養環境pH為6.0～8.0時，細菌黏附數無顯著變化(P＞0.05)。當培養環境pH達到9.0時，此時黏附的細菌數出現顯著下降趨勢(P＜0.01)。可以得出:培養環境的pH低于6.0時，黏附的細菌數對培養環境pH有一定的依賴性。然而當培養環境的pH高于8.0時，黏附細菌數明顯下降。由此可以看出，弱酸環境更有利于植物乳桿菌L0的黏附過程的發生。與陳臣［11］研究得出的中性環境更利于黏附的發生有所不同，這可能是酸性環境改變Caco-2細胞表面的某些理化性質，導致菌體與細胞黏附作用增強，從而使更多的植物乳桿菌L01黏附到Caco-2細胞表面上，并且不易脫落;另一方面，這可能是菌體之間的差異性造成的結果，植物乳桿菌L01具有更好的耐酸性。

2.5 單糖種類對黏附性的影響

在細菌懸浮液中分別加入D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、甲基-α-D-甘露糖苷(終濃度為100 mmol/L)，空白對照組加入等量的PBS緩沖液，進行黏附實驗。分析實驗結果圖5可知，當加入4種不同的單糖時，甲基-α-D-甘露糖苷(P ＜0.01)，D-甘露糖(P ＜0.01)均能顯著抑制植物乳桿菌L01對Caco-2的黏附作用，黏附的細菌數有了明顯的減少。另外兩種單糖D-葡萄糖(P ＞0.05)，D-半乳糖(P ＞0.05)均不能抑制其黏附作用。分析FERREIRA［12］在2011年研究得出的細菌的黏附能力與菌體表面性質存在較大相關性的結論，同時參考 GARCíA-CAYUELA T［13］的關于黏附涉及蛋白質、糖脂和單糖等黏附素特異性黏附的研究，可以推測得知由于甘露糖及其衍生物與乳桿菌細胞壁中含多糖表面的糖基部分相似，代替乳桿菌與細胞發生特異性結合的，故導致了細菌的黏附數明顯下降。

圖5 單糖對植物乳桿菌L01黏附于Caco-2的影響Fig.5 The effect of different monosaccharide on the adherence of of L.plantnum L01 on Caco-2 cells

2.6 二價金屬離子對黏附作用的影響

在濃度調整為1×108CFU/mL的L01菌懸液中分別加入CaCl2和 MgCl2，使其終濃度分別為0，5，10，15，20 mmol/L，然后進行黏附實驗。實驗結果圖6所示。由圖6可知，隨著金屬離子濃度的升高，黏附的細菌數無明顯變化(P＞0.05)。此結果說明Ca2+和Mg2+這兩種金屬離子并未參與到植物乳桿菌L01黏附過程。Crow等［14］人曾研究發現，乳酸菌與細胞表面的靜電相互作用是兩者的初步結合，金屬離子Ca2+、Mg2+會參與到此黏附過程。但是本實驗并未得到與其一致的結論。通過統計學分析可知，Ca2+、Mg2+的加入對黏附作用無顯著影響(P＞0.05)。REN［15］的研究曾指出，乳酸菌的疏水性與其黏附作用存在一定的相關性，由此我們可以推測得知植物乳桿菌L01在與Caco-2的黏附過程的結合先是疏水作用，之后才是表面黏附素與受體結合［13］。故Ca2+、Mg2+并未參與植物乳桿菌L01的黏附。

圖6 二價金屬離子對植物乳桿菌L01黏附于Caco-2的影響Fig.6 The effect of different ion concentrations on the adherence of of L.plantnum L01 on Caco-2 cells

3 結論

本文考察了菌體濃度、菌體生長階段、pH、作用時間、金屬離子以及單糖種類等六種因素對植物乳桿菌L01黏附Caco-2細胞的性能的影響。結果表明，當細菌濃度達到1×108CFU/mL、孵育2 h時，黏附趨于飽和。穩定期的植物乳桿菌L01對Caco-2細胞的黏附效果最好。植物乳桿菌L01在弱酸偏中性范圍黏附性最強;考察4種單糖對植物乳桿菌L01黏附抑制作用發現，甲基-α-D-甘露糖苷，D-甘露糖均能顯著抑制植物其黏附作用，D-葡萄糖、D-半乳糖均無明顯變化。同時，研究發現，Ca2+、Mg2+并未對植物乳桿菌L01黏附于Caco-2細胞造成顯著影響，說明Ca2+、Mg2+并未參與植物乳桿菌L01的黏附過程，植物乳桿菌L01與Caco-2的初步結合并非靜電相互作用導致，而是由疏水相互作用引起的。

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