NH4+對(duì)合成氣乙醇發(fā)酵過(guò)程的影響及其酶學(xué)機(jī)理*

張炎達(dá)，王風(fēng)芹，彭一丁，謝慧，宋安東

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州，450002)

全球能源消耗預(yù)計(jì)到2030年將增加57%，化石燃料的大規(guī)模使用同時(shí)還帶來(lái)諸多的能源緊缺、環(huán)境壓力加劇和燃料價(jià)格大幅度上漲等問(wèn)題［1］，這就使得各國(guó)政府急切尋求一種可持續(xù)環(huán)保的再生綠色能源，其中生物燃料乙醇得到了世界廣泛關(guān)注［2］。合成氣乙醇發(fā)酵是目前公認(rèn)的一種極具潛力和競(jìng)爭(zhēng)力的生物燃料乙醇生產(chǎn)技術(shù)［3］，該技術(shù)具有原料來(lái)源廣泛、生物催化特異性高、能耗低、耐毒性強(qiáng)和H2∶CO的無(wú)限制比率等優(yōu)點(diǎn)［4］。合成氣是由氣化原材料，如農(nóng)林業(yè)廢棄物和生活有機(jī)廢物等各種生物質(zhì)材料、工業(yè)廢氣、次品煤和天然氣等［5-6］經(jīng)氣化裝置在高溫下含有水蒸氣和氧的條件下裂解為富含H2、CO和CO2三種主要成分的混合氣體，另外還包括其他組分，如:NH3、CH4、NOx、N2、C2H2、C2H4、C6H6、C2H6、SO2和焦油等［7］，但根據(jù)原料和氣化設(shè)備不同，合成氣的組分和比列略有差異［8-9］。

合成氣厭氧乙醇發(fā)酵微生物目前的種類(lèi)及數(shù)量較少，且乙醇發(fā)酵產(chǎn)量較低，如C.ljungdahlii和C.autoethanogenum等［10］，而國(guó)內(nèi)還未有新菌的報(bào)道。Wood-Ljungdahl途徑是該類(lèi)菌體的唯一代謝路徑，且氫化酶(H2ase，hydrogenase)、一氧化碳脫氫酶(CODH，carbon monoxide dehydrogenase)、乙醇脫氫酶(ADH，alcohol dehydrogenase)和乙酸激酶(ACK，acetate kinase)為其四大關(guān)鍵酶，而H2ase為還原力代謝的必需酶［3，7］，H2ase活性的高低與 CO 利用效率的大小成正相關(guān)。在合成氣乙醇發(fā)酵中，合成氣雜質(zhì)氣體多對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生有害影響，如Asma Ahmed等人［11］發(fā)現(xiàn)，微量的焦油和NO能抑制發(fā)酵和促進(jìn)菌體休眠。同時(shí)，NO抑制合成氣發(fā)酵菌C.carboxidivorans的 H2ase活性而阻礙 H2利用［12］。XU 等［13］還得出合成氣中的NH3為H2ase的非競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的結(jié)論。研究發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)氣體NH3極易溶解于發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，能快速轉(zhuǎn)化為NH4+且其濃度不斷累積［14］，同時(shí)雜質(zhì)NH3還會(huì)腐蝕設(shè)備，工業(yè)上常利用濕式洗滌技術(shù)進(jìn)行脫氨處理［15］，因而NH3對(duì)未來(lái)合成氣乙醇發(fā)酵工業(yè)化影響較大。相比，有關(guān)合成氣雜質(zhì)氣體NH3對(duì)合成氣乙醇發(fā)酵過(guò)程的影響還未有報(bào)道，且NH3對(duì)發(fā)酵代謝關(guān)鍵酶的作用也未有研究，為此，本文系統(tǒng)研究了不同初始濃度的NH4+(NH4Cl)對(duì)菌株A-fm4，C.ljungdahlii和 C.autoethanogenum DSM10061利用生物質(zhì)合成氣發(fā)酵乙醇的影響，并進(jìn)一步測(cè)定菌株在菌體生長(zhǎng)期和乙醇發(fā)酵期內(nèi)4種關(guān)鍵酶的活性變化。以期研究NH3對(duì)合成氣乙醇發(fā)酵的影響和作用機(jī)理，為未來(lái)合成氣乙醇發(fā)酵工業(yè)化發(fā)展提供參考依據(jù)。另外，實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了菌株耐銨能力的研究，便于為日后耐銨菌株馴化提供菌種材料，希望獲得能夠利用含NH3粗合成氣組分發(fā)酵的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株 A-fm4富集自羊駝的新鮮糞便［16］;菌株Closlridium ljungdahlii和Closlridium autoethanogenum DSM10061均購(gòu)自德國(guó)微生物菌種保藏中心(DSMZ)。

1.2 生物質(zhì)合成氣

實(shí)驗(yàn)用合成氣按照玉米秸稈氣化氣組分配制，成分及比例如下:CO 85.5%，H210%，CO24.5%。購(gòu)于河南源正科技發(fā)展有限公司。

1.3 培養(yǎng)基及配制方法

種子培養(yǎng)基(g/L)［17］:NaCl 0.80，NH4Cl 1.00，KCl 0.10，MgSO4·7H2O 0.20，CaCl20.04，KH2PO40.20，NaHCO31.00，酵母膏 1.00，MES［2-(N-嗎啡啉)乙磺酸］5.00，L-鹽酸半胱氨酸0.40，木糖5.00。添加微量元素溶液10 mL和維生素溶液10mL，pH 5.75。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)［17］:NH4Cl 1.00，NaCl 1.00，MgSO40.15，KH2PO40.10，CaCl20.04，胰蛋白胨2.00，酵母膏0.30，L-鹽酸半胱氨酸0.20，MES 10.00，礦質(zhì)元素溶液10 mL，維生素溶液10 mL，pH 7.0。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵培養(yǎng)基初始NH4+濃度設(shè)置了6個(gè)梯度，分別為 0X、0.5X、1X、2X、4X 和 8X，因雜質(zhì)氣體NH3極易溶解于發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，且能夠快速轉(zhuǎn)化為NH4+使得 NH4+濃度不斷累積［14］，所以實(shí)驗(yàn)中利用NH4+的濃度進(jìn)行研究，即，將原發(fā)酵培養(yǎng)基的NH4Cl濃度標(biāo)記為1 X。

維生素溶液均采用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌，待接種后添加至培養(yǎng)基內(nèi)。

上述所有培養(yǎng)基均準(zhǔn)確配制，每80 mL培養(yǎng)液分裝至200 mL厭氧培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)(發(fā)酵培養(yǎng)基為每60 mL培養(yǎng)液分裝至300 mL厭氧培養(yǎng)瓶?jī)?nèi))，再轉(zhuǎn)入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱內(nèi)添加刃天青0.5 mg/L，靜置直至瓶?jī)?nèi)顏色由粉色轉(zhuǎn)為無(wú)色時(shí)分別蓋上瓶塞，于121℃滅菌20 min(滅菌過(guò)程中瓶塞插入針頭)。滅菌后立刻拔去針頭且移至厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)，待溫度降至約37℃時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 合成氣厭氧乙醇發(fā)酵

菌種活化參考文獻(xiàn)［16］，將對(duì)數(shù)期的各菌種子液按10%接種量轉(zhuǎn)接至含有60 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的厭氧培養(yǎng)瓶中，用注射器向厭氧瓶?jī)?nèi)加入240 mL合成氣(以上操作均在厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)完成)。37℃，150 r/min搖床發(fā)酵7 d，每24 h取樣測(cè)OD600值及乙醇含量。

1.5 產(chǎn)物測(cè)定及計(jì)算方法

1.5.1 乙醇和乙酸含量測(cè)定

將1.5 mL發(fā)酵液于4℃，8 000 r/min離心10 min，上清液用于兩者濃度的測(cè)量。測(cè)定條件為:FID檢測(cè)器，柱子為30 m ×0.32 mm ×0.3 μm HP-FFAP，氮?dú)庾鳛檩d氣，起始3 min流速為1.9 mL/min，再以0.5 mL/min 升至 4 mL/min，分流比 50∶1，柱箱起始溫度40℃，保持1.5 min后以40℃/min達(dá)到210℃并保持2 min，色譜進(jìn)樣口和檢測(cè)器的溫度分別為200℃和250℃。

1.5.2 細(xì)胞干重和指標(biāo)計(jì)算

根據(jù)OD值及其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞干重(DCW)可獲得發(fā)酵菌株的干重(y，g/L)與OD值(x)關(guān)系回歸方程式。

1.6 關(guān)鍵酶活性測(cè)定

關(guān)鍵酶H2ase、CODH和ADH活性測(cè)定方法分別參考文獻(xiàn)［18］;關(guān)鍵酶ACK活性測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［19］和［20］，稍有改進(jìn)。反應(yīng)為:H2ase活性反應(yīng)體系具體包含:0.4 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH=7.5)，0.2 mL 0.04 mol/L甲基紫精，0.2 mL 0.04 mol/L二硫蘇糖醇，0.1 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的Triton-X100，2 mL脫氣去離子水;CODH活性反應(yīng)體系具體包含:0.8 mL 0.5 mol/L Tris-HCl(pH=6.8)，0.2 mL 0.04 mol/L甲基紫精(MV)，0.2 mL 0.04 mol/L二硫蘇糖醇，0.1 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的Triton-X100，1.2 mL脫氣去離子水。ADH活性反應(yīng)體系具體包含:0.4 mL 1 mol/L Tris-Hcl(pH=7.5)，0.12 mL 0.01 M NADH，0.4 mL 0.1 M 乙醛，0.5 mL 0.08 mol/L 二硫蘇糖醇，0.1 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的Triton-X100，1.5 mL脫氣去離子水;ACK活性反應(yīng)體系具體包含:0.145 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH=7.5)，0.1 mL 2 mol/L乙酸鉀，0.25 mL 0.08 mol/L二硫蘇糖醇，0.1 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的Triton-X100，0.1 mL 0.1 mol/L MgCl2，0.1 mL 0.1 mol/L ATP，0.2 mL 3.5 mol/L 中性NH4OH-HCl，2 mL脫氣去離子水。且二硫蘇糖醇溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

式中:△OD為吸收值每分鐘降低的變化值，min-1;V為反應(yīng)體系的體積，mL;E為摩爾消光系數(shù)，103L/(mol·cm);0.56為96孔板的光程，cm;C為測(cè)定中所加入菌體干物質(zhì)量，g;106為摩爾轉(zhuǎn)化為微摩爾的系數(shù)。酶活單位:單位干菌體每分鐘還原1 μmol MV(1e-1還原)。

1.7 NH4+對(duì)菌株生長(zhǎng)半抑制濃度

NH4+對(duì)發(fā)酵菌株生長(zhǎng)半抑制濃度(Ki)的計(jì)算參考文獻(xiàn)［21］，通過(guò)對(duì)比不同發(fā)酵菌株的Ki值大小來(lái)衡量菌株的NH4+耐受能力強(qiáng)弱。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析方法

為比較在不同初始NH4+濃度下對(duì)菌株發(fā)酵乙醇產(chǎn)量及其各發(fā)酵參數(shù)的影響，同時(shí)分析比較對(duì)兩時(shí)期4種關(guān)鍵酶活性水平的差異，實(shí)驗(yàn)分別采用了方差分析和t值檢驗(yàn)，以上各統(tǒng)計(jì)分析均由軟件SPSS16.0完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 初始N H4+濃度對(duì)合成氣發(fā)酵菌株生長(zhǎng)的影響

不同梯度濃度NH4+對(duì)發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)影響見(jiàn)圖1。菌株 A-fm4、C.ljungdahlii和 C.autoethanogenum的生物量分別在NH4+濃度0.5X、0X和0X于發(fā)酵4 d、1 d和2 d達(dá)到最大，菌體量分別為:0.045，0.166和0.097 g/L。菌株 A-fm4和 C.autoethanogenum DSM10061的生長(zhǎng)過(guò)程受NH4+影響明顯，NH4+對(duì)菌株C.ljungdahlii的影響主要表現(xiàn)在生長(zhǎng)穩(wěn)定期及以后，且隨NH4+梯度濃度增大對(duì)菌株生長(zhǎng)量和生長(zhǎng)速率具有抑制能力。

由此可知，合成氣發(fā)酵菌株對(duì)無(wú)機(jī)氮源的利用有限，發(fā)酵液內(nèi)NH4+累積濃度高于9.35 mmol/L時(shí)生長(zhǎng)受到不同程度的抑制作用。據(jù)報(bào)道，Escherichia coli已作為一種模式生物進(jìn)行研究細(xì)菌對(duì)NH4+的吸收和排除是經(jīng)過(guò)一種高K+親和性的K+-NH4+交換系統(tǒng)(Kdp)［22］，其中 Buurman 等［23］對(duì) E.coli在高濃度NH4+環(huán)境中代謝活動(dòng)的研究發(fā)現(xiàn)在高濃度NH4+條件下需要一種額外轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，即Kdp，來(lái)負(fù)責(zé)NH4+的攝入和泵出維持胞內(nèi)外NH4+正常梯度及胞內(nèi)pH的穩(wěn)定，且高濃度NH4+使得菌體對(duì)能量的利用效率顯著降低。同樣，葉貴子等［21］對(duì)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的研究也得到相似結(jié)果。雖然目前還未見(jiàn)針對(duì)合成氣厭氧發(fā)酵菌在Kdp系統(tǒng)與能量效率方面的確切報(bào)道，但可推測(cè)在本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵菌體細(xì)胞內(nèi)也存在類(lèi)似機(jī)制。另外，數(shù)據(jù)顯示K+的水合半徑為5.32，近于NH4+的5.37，NH4+對(duì)K+在細(xì)胞膜同一載體上可競(jìng)爭(zhēng)同一結(jié)合部位，這一競(jìng)爭(zhēng)會(huì)破壞K+對(duì)細(xì)胞正常的生理功能，且隨NH4+濃度的增大不斷顯著，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)菌體的生長(zhǎng)抑制。

圖1 不同梯度NH4+濃度下發(fā)酵菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of organisms at different concentrations of NH4+

2.2 初始NH4+濃度對(duì)合成氣發(fā)酵乙醇特性的影響

菌株 A-fm4、C.autoethanogenum DSM10061和C.ljungdahlii的乙醇產(chǎn)量均在NH4+濃度0X下于發(fā)酵5 d、2 d和3 d達(dá)到最大，其乙醇量分別為124.56，137.71和137.67 mg/L(圖2)。其中，菌群A-fm4的乙醇發(fā)酵受NH4+濃度影響最大，其次為菌株C.autoethanogenum DSM10061，再次是菌株 C.ljungdahlii。NH4+濃度高于0.5X(9.35 mmol/L)時(shí)開(kāi)始減緩菌株乙醇發(fā)酵速率，當(dāng)濃度高于4X(74.8 mmol/L)其抑制作用更顯著，因此不存在或低濃度NH4+會(huì)促進(jìn)乙醇發(fā)酵，高濃度NH4+能降低乙醇發(fā)酵能力。

圖2 不同梯度NH4+濃度下乙醇產(chǎn)量Fig.2 Ethanol production fermented at different concentrations of NH4+

2.3 初始N H4+濃度對(duì)合成氣發(fā)酵乙酸特性的影響

圖3為不同梯度濃度NH4+對(duì)合成氣發(fā)酵菌株發(fā)酵乙酸特性的影響。菌株A-fm4、C.autoethanogenum DSM10061和C.ljungdahlii的乙酸產(chǎn)量分別在NH4+濃度2X、2X和0X或2X下于發(fā)酵5 d、4 d和3 d或4 d達(dá)到最大，乙酸量分別為218.19，302.72和304.80或304.95 mg/L。相比菌株A-fm4和C.autoethanogenum，菌株C.ljungdahlii乙酸發(fā)酵受 NH4+影響較弱，另外，NH4+濃度0.5X～4X(9.35～74.8 mmol/L)能不同程度地促進(jìn)菌株A-fm4、C.autoethanogenum DSM10061和C.ljungdahlii乙酸發(fā)酵速率。結(jié)果表明，NH4Cl濃度在18.7～74.8 mmol/L會(huì)促進(jìn)乙酸的發(fā)酵，濃度為149.6 mmol/L抑制乙酸發(fā)酵。

圖3 不同梯度NH4+濃度下乙酸產(chǎn)量Fig.3 Acetate production fermented at different concentrations of NH4+

綜合分析發(fā)酵菌株在不同梯度NH4+環(huán)境內(nèi)的發(fā)酵情況可得:低濃度NH4+利于乙醇和乙酸發(fā)酵，高濃度NH4+對(duì)乙醇和乙酸均表現(xiàn)出抑制作用。當(dāng)NH4+濃度高于9.35 mmol/L時(shí)，乙醇發(fā)酵隨濃度的增大而抑制顯著，NH4+濃度為18.7～74.8 mmol/L時(shí)會(huì)促進(jìn)乙酸的發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)不含NH4+時(shí)利于更多的代謝流流向乙醇，促進(jìn)乙醇且減弱乙酸發(fā)酵。

2.4 初始NH4+濃度對(duì)合成氣發(fā)酵代謝關(guān)鍵酶活性的影響

不同初始NH4+濃度對(duì)合成氣厭氧發(fā)酵菌株發(fā)酵代謝途徑關(guān)鍵酶活性變化的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。H2ase和CODH酶活水平隨NH4+濃度增大而抑制極顯著(P＜0.01)，生長(zhǎng)期酶活水平高于發(fā)酵期，NH4+濃度低于2X(37.4 mmol/L)促進(jìn)菌株A-fm4該酶的高水平維持(A1～C1，A2～C2);除菌株 C.ljungdahlii外(B3)，NH4+濃度大于2X(37.4 mmol/L)時(shí)ADH酶活大小受到抑制作用，其中菌株A-fm4生長(zhǎng)期酶活水平大于發(fā)酵期，兩時(shí)期酶活均受NH4+影響顯著(A3)，菌株C.autoethanogenum DSM10061生長(zhǎng)期酶活水平受NH4+影響，而發(fā)酵期 ADH酶活大小趨于穩(wěn)定(C3)。相比，菌株C.ljungdahlii兩時(shí)期ADH酶活均受NH4+影響較小;對(duì)于ACK，菌株A-fm4和C.ljungdahlii在低濃度和高濃度NH4+下其活性水平均受抑制，NH4+濃度1X～2X(18.7 mmol/L～37.4 mmol/L)可促進(jìn)ACK活性，且生長(zhǎng)期酶活水平一般高于發(fā)酵期(A4和B4)，而菌株C.autoethanogenum DSM10061在NH4+濃度低于2X(37.4 mmol/L)時(shí)可維持較高活性水平，高濃度NH4+抑制酶活(C4)。因此，低濃度NH4+可促進(jìn)關(guān)鍵酶活性，高濃度NH4+具有抑制作用，且生長(zhǎng)期酶活水平較大于發(fā)酵期的值。

Wood-Ljungdahl代謝途徑中H2ase和CODH可分別通過(guò)催化氧化H2和CO產(chǎn)生還原力和質(zhì)子，其中H2ase為代謝過(guò)程中還原力獲得的必需酶，H2ase活性水平會(huì)直接影響到 CO的利用效率，高活性H2ase可弱化由CO經(jīng)CODH產(chǎn)生還原力的途徑，促進(jìn)CO作為碳源和能源，而H2ase低活性時(shí)其結(jié)果相反［1］。由上述結(jié)果可知，NH4+濃度能影響 H2ase和CODH的活性大小，而對(duì)H2ase的活性影響顯著，因此從酶學(xué)層面上可解釋NH4+濃度大于2X時(shí)逐漸抑制發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)，而低濃度或不存在NH4+可促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)(圖1)。另外，NH4+對(duì)H2ase和CODH的抑制機(jī)制可理解如下，即，NH3和NH4+在發(fā)酵液中快速轉(zhuǎn)化，NH3易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，繼續(xù)電離NH4+［24］，改變胞漿內(nèi)外的原有正常NH4+梯度，使得H2ase和CODH暴露于更多NH4+環(huán)境內(nèi)，自由NH4+的增多影響到酶結(jié)構(gòu)域的電位變化導(dǎo)致其活性降低，NH4+濃度越高抑制酶活作用越強(qiáng)。研究證明，H2ase和CODH常依附于胞膜內(nèi)側(cè)［25］，鑒于高濃度NH4+會(huì)對(duì)其抑制及NH3易出入細(xì)胞膜的能力，可假設(shè)在菌株發(fā)酵中存在于菌體胞內(nèi)的H2ase和CODH受NH4+抑制濃度可能為37.4 mmol/L。ADH是 Wood-Ljungdahl中乙醇代謝的關(guān)鍵酶，實(shí)驗(yàn)中菌株 A-fm4的ADH酶活受NH4+濃度影響顯著，當(dāng)NH4+濃度在2X以?xún)?nèi)時(shí)該酶活性維持較高水平(圖4-A3)，進(jìn)而促進(jìn)乙醇發(fā)酵(圖2-A)。對(duì)于該菌群，理論上ADH酶活應(yīng)在發(fā)酵期達(dá)到較高水平，實(shí)際上發(fā)酵期獲得最大乙醇產(chǎn)量但其活性降低，可能的解釋是ADH活性雖在后期降低，但足以滿(mǎn)足合成乙醇所必須的酶活大小，或是在發(fā)酵期ADH隨著發(fā)酵環(huán)境的改變ADH活性降低，但在菌體內(nèi)的表達(dá)量卻在增加來(lái)滿(mǎn)足乙醇代謝［18］。針對(duì)菌株 C.ljungdahlii和 C.autoethanogenum DSM10061，ADH的活性受NH4+影響小，酶活水平相當(dāng)，具有一定的耐受能力，有學(xué)者［26］對(duì)菌體C.ljungdahlli內(nèi)參基因穩(wěn)定性及重要基因表達(dá)量的研究發(fā)現(xiàn)，與乙醇合成相關(guān)的重要基因aor2在不同碳源內(nèi)的表達(dá)量穩(wěn)定，這可提示本實(shí)驗(yàn)兩菌株在不同濃度NH4+發(fā)酵環(huán)境中該基因或ADH相關(guān)重要基因也存在類(lèi)似穩(wěn)定表達(dá)的能力進(jìn)而使得ADH活性水平穩(wěn)定，只是對(duì)于C.autoethanogenum DSM10061這種穩(wěn)定表達(dá)在乙醇發(fā)酵期得到主要體現(xiàn)。另外，菌株C.ljungdahlii和C.autoethanogenum DSM10061在乙醇發(fā)酵期的ADH雖具有一定的耐受性(圖4-B3，B4)，但乙醇產(chǎn)量卻低于低NH4+濃度(小于2X)的發(fā)酵乙醇產(chǎn)量，關(guān)鍵問(wèn)題是在較高NH4+濃度下H2ase活性受到抑制，進(jìn)而在代謝流中用于乙醇代謝的還原力減少導(dǎo)致乙醇合成降低。

合成氣厭氧發(fā)酵的乙酸發(fā)酵離不開(kāi)關(guān)鍵酶ACK，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NH4+濃度在18.7～37.4 mmol/L可促進(jìn)其活性，相繼乙酸產(chǎn)量增加(圖3)。室溫下，乙酸解離常數(shù)pKa為4.75，在菌體胞漿的偏中性中其主要以 Ac-和 H+存在，因此在1X和2X下胞內(nèi)NH4+的電離利于胞漿正常pH范圍的穩(wěn)定，減少大量乙酸在胞內(nèi)對(duì)酶促反應(yīng)的抑制，隨分子乙酸由細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制［27］不斷移出胞內(nèi)使發(fā)酵液內(nèi)乙酸濃度不斷增加。基于0X下促進(jìn)乙醇而降低乙酸發(fā)酵，因此當(dāng)不存在NH4+時(shí)利于更多的代謝流流向乙醇。

2.5 發(fā)酵菌株對(duì)NH4+的耐受能力對(duì)比

由表1知，NH4+對(duì)不同種類(lèi)發(fā)酵菌的生長(zhǎng)抑制程度不同，3種發(fā)酵出發(fā)菌中僅菌株A-fm4對(duì)NH4+最為敏感，其 Ki值為 123.61 mmol/L。相比，菌株 C.ljungdahlii和 C.autoethanogenum DSM10061的 Ki值分別為208.13 mmol/L和240.37 mmol/L，耐NH4+能力較強(qiáng)，這或許為未來(lái)該菌直接利用含氨氣的粗制合成氣發(fā)酵乙醇提供重要啟示。同時(shí)菌株C.ljungdahlii和C.autoethanogenum DSM10061可為未來(lái)工業(yè)菌株耐銨馴化提供菌種材料，耐銨菌種的使用利于合成氣厭氧乙醇發(fā)酵的工業(yè)化進(jìn)程，為降低粗制合成氣脫氨設(shè)備的資金投入甚至刪減脫氨工藝工序都具有重要意義。

表1 NH4+對(duì)發(fā)酵菌株的半抑制常數(shù)(Ki)Table 1 Ammnia half-inhibitin constant(Ki)for fermentation microorganisms

圖4 NH4+對(duì)菌株發(fā)酵過(guò)程中兩時(shí)期關(guān)鍵酶活性的影響Fig.4 The activity of key enzymes existed in growth period and ethanol fermentation period at different concentrations of NH4+

3 結(jié)論

(1)發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)不同初始濃度的NH4+對(duì)菌株A-fm4，C.ljungdahlii和 C.autoethanogenum DSM10061發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)影響顯著，其中對(duì)菌株C.ljungdahlii的影響主要表現(xiàn)在生長(zhǎng)穩(wěn)定期及以后。結(jié)果表明，菌株 A-fm4、C.ljungdahlii和 C.autoethanogenum DSM10061分別在NH4+濃度0.5X、0X和0X下獲得最大生物量，分別為0.045，0.166和0.097 g/L。當(dāng)NH4+濃度高于9.35 mmol/L時(shí)，隨NH4+梯度濃度增大對(duì)菌株生長(zhǎng)量和生長(zhǎng)速率具有抑制能作用。

(2)綜合分析合成氣發(fā)酵過(guò)程可知:低濃度NH4+利于乙醇和乙酸發(fā)酵，高濃度NH4+對(duì)乙醇和乙酸均表現(xiàn)出抑制作用。當(dāng)NH4+濃度高于9.35 mmol/L時(shí)，乙醇發(fā)酵隨濃度的增大而抑制顯著，NH4+濃度為18.7～74.8 mmol/L時(shí)會(huì)促進(jìn)乙酸的發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)不含NH4+時(shí)利于更多的代謝流流向乙醇，促進(jìn)乙醇且減弱乙酸發(fā)酵。

(3)關(guān)鍵酶 H2ase，CODH，ADH和 ACK均受高濃度(149.6 mmol/L)NH4+抑制，且菌體生長(zhǎng)期的酶活水平一般高于發(fā)酵期，H2ase和CODH隨NH4+濃度升高而酶活下降極顯著，H2ase活性的高低顯著影響發(fā)酵過(guò)程中還原力的供給，直接影響菌體生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵。除菌株A-fm4外，菌株C.ljungdahlii和C.autoethanogenum DSM10061的ADH受NH4+影響較小，推測(cè)該酶在胞內(nèi)具有穩(wěn)定表達(dá)機(jī)制。NH4+濃度1X～2X(18.7～37.4 mmol/L)可促進(jìn)ACK活性，且不存在NH4+時(shí)也會(huì)降低該酶活性。

(4)菌株 C.ljungdahlii和 C.autoethanogenum DSM10061的Ki值分別為208.13 mmol/L和240.37 mmol/L，耐銨能力較強(qiáng)，可為未來(lái)耐銨菌種的馴化提供菌種材料，為將來(lái)降低脫氨設(shè)備資金投入和減少合成氣凈化的復(fù)雜工序提供技術(shù)準(zhǔn)備。

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