灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶的自誘導表達及兩階段溫度控制發酵的優化

楊鑫，吳茜，崔懷言，徐嫻，朱麗英，江凌，2

1(南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京，210009)

2(南京工業大學 食品與輕工學院，江蘇南京，210009)3(南京工業大學理學院，江蘇南京，210009)

海藻糖是自然界中普遍存在的一種非還原性二糖，作為一種天然的非特異性生物保護劑備受人們的矚目［1］。隨著海藻糖應用范圍日益擴大，市場需求不斷增加，開發一種簡單經濟的海藻糖生產工藝是目前亟待解決的問題。海藻糖合成酶(trehalose synthase，EC 5.4.99.16)是一種新型變位酶，通過分子內轉糖基作用將α，α-1，4糖苷鍵連接的麥芽糖一步轉化為α，α-1，1糖苷鍵連接的海藻糖，工藝簡單，易于調控，適合工業放大生產。海藻糖合成酶一步酶催化過程既不消耗高能物質(如UDP，二磷酸尿核苷)，也不依賴磷酸，且底物麥芽糖目前生產技術成熟，廉價易得，與成品海藻糖相比有較大的價格空間［2］?，F已發現的海藻糖合成酶分子量集中在60～80 kDa，報道的麥芽糖轉化率在50%～70%左右，其中轉化率較高的海藻糖合成酶基因多來自極端微生物和嗜熱菌，也體現了海藻糖的抗逆功能［3］。因此，海藻糖合成酶以麥芽糖為底物生產海藻糖是一條極有工業化前景的途徑。

自誘導(auto-induction)［3-4］與傳統的 IPTG(異丙基-β-D硫代半乳糖苷)誘導方法相比，接種后不需對細胞的生長情況進行監測，極大地方便了高通量篩選;且以價格低廉、無毒的乳糖替代IPTG可大大降低生產成本，在重組蛋白的發酵生產中有著重要的意義。此外，針對重組蛋白的誘導表達，采用兩階段溫度調控策略［5］，先在37℃下培養增加菌體量，然后降低溫度到25℃減緩重組蛋白的合成速率以促進蛋白的正確折疊。小分子物質乙醇在大腸桿菌物質代謝過程中具有多重作用，如改變油脂的不飽和度，調節糖酵解通量，本文將有效劑量的乙醇添加到細菌生長后期，以期提高可溶性蛋白的表達量［6-8］?；诖耍疚目寺×嘶耶a色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)海藻糖合成酶基因，將該基因插入表達載體pET28a中，導入E.coli中高效表達并對其自誘導發酵條件進行了優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

灰產色鏈霉菌(S.griseochromogenes)YX-1為本實驗室保存，大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)為本實驗室保存;質粒pET28a，pMD20-T購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑和儀器

Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性核酸內切酶(NdeⅠ、HindⅢ)、DNA Marker均購自TaKaRa公司;DNA凝膠回收試劑盒、DNA質粒提取試劑盒均購自TaKaRa公司;引物合成和測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成;PCR儀、DNA凝膠電泳儀、DNA凝膠成像儀、蛋白SDS-PAGE電泳儀和成像儀均購自Bio-Rad公司;海藻糖標準樣品和麥芽糖標準樣品為色譜分析純;其余試劑均為國產分析純。

1.2 培養基及培養條件

大腸桿菌LB培養基配置參照分子克?。?］;自誘導培養基［10］:甘油 5 g/L，大豆蛋白胨 10 g/L，Na2HPO46 g/L，K2HPO46 g/L，NH4Cl 1 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO4·7 H2O 6 g/L［1］。大腸桿菌的普通LB培養溫度為37℃，自誘導培養條件為30℃，兩階段溫度培養條件為37℃培養2.5 h，25℃培養14 h。

1.3 PCR擴增目的基因Tres

通過比對海藻糖合成酶基因的保守序列，分析設計了簡并 PCR 引物［11］。引物為 F-jian、R-jian(表1)。純化后的PCR擴增產物與pMD20-T連接，送金唯智測序公司進行測序分析。根據測序得到的灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶核苷酸序列，設計上游引物、下游引物(表1)，下劃線為酶切位點，便于連接到表達載體pET28a上。PCR條件按94℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，完成30個循環后72℃后延伸5 min。將PCR產物連接T載體后與pET28a質粒同時進行NdeⅠ、HindⅢ雙酶切，酶切產物連接，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，篩選得到的重組質粒命名為pET28a-tres，委托蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。

表1 簡并PCR引物和克隆引物Table 1 Primers for degenerated PCR and cloning

1.4 重組海藻糖合成酶SDS-PAGE分析及酶活測定［12］

1.4.1 重組海藻糖合成酶表達產物的分離及SDSPAGE分析

重組菌于LB培養基中(含終濃度50 mg/L卡納霉素)，37℃過夜培養，再以1%的接種量接種至新鮮的LB培養基中，37℃、200 r/min搖床振蕩培養至OD600為0.6～0.8時，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)，30℃誘導表達14 h，取2 mL發酵液，12 000 ×g離心1 min收集菌體，0.04 mol/L的磷酸緩沖(PBS)液清洗兩次(pH 7.0)，加等體積的PBS重懸，超聲破碎離心得上清，取30 μL粗酶液和10 μL 4 ×SDS-PAGE loading buffer混合，沸水煮沸5 min。取5 μL進行SDS-PAGE分析。確定表達產物的蛋白分子量和表達程度。

1.4.2 海藻糖的檢測

取200 μL超聲破碎粗酶液加入800 μL用0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液PBS(pH 7.0)配置的0.15 mol/L麥芽糖溶液，30℃反應1.5 h后，沸水浴5 min，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測體系中海藻糖的含量。轉化率測定反應體系:50 mL反應液裝于150 mL三角瓶中，反應液是以0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制的30%(w/v)麥芽糖溶液加入50 mL培養菌液離心菌體中進行全細胞催化，30℃反應24 h，取樣測定海藻糖轉化率。

分析條件:色譜柱:Shodex SUGAR SZ5532柱(6.0 mm ID ×150 mm);檢測器:Shodex RI101;柱溫:60℃，壓力:30×105Pa;反應樣品稀釋10倍，進樣 10 μL;流動相為乙腈∶水(75∶25);流速:1.0 mL/min。酶活力單位定義:在最適條件下，1 min轉化1 nmol麥芽糖為海藻糖所需海藻糖合成酶的量為1個酶活單位(1U)。

1.5 重組海藻糖合成酶工程菌發酵條件優化

1.5.1 LB發酵和自誘導發酵酶活對比

30℃ IPTG誘導發酵及自誘導發酵8、10、12 h，分別取2 mL發酵液，HPLC測定酶活。

1.5.2 自誘導發酵培養的最適溫度

以1%的接種量接種到自誘導培養基，本研究選擇37、30、25 ℃三個培養溫度，培養 10、12、14、16、18 h后分別取2 mL發酵液，HPLC測定酶活。

1.6 兩階段溫度控制培養條件的優化

1.6.1 最適兩階段溫度控制培養條件

以1%的接種量接種到自誘導培養基，37℃培養2.5 h后，分別在30和25℃繼續培養，不同培養時間下(10、12、14、16、19、21 h)分別取2 mL 發酵液，選取30℃恒溫培養作為對照，HPLC測定酶活。

1.6.2 添加小分子物質

以1%的接種量接種到自誘導培養基，37℃培養2.5 h后，25℃繼續培養，14 h后添加3%乙醇，以不添加乙醇作為對照，不同培養時間(16，19 h)分別取2 mL培養液，HPLC測定酶活。并對粗酶液進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，分析不同條件下蛋白表達量的變化。

2 結果與分析

2.1 灰產色鏈霉菌Tres基因的克隆及序列分析

以灰產色鏈霉菌總DNA為模板，簡并PCR擴增獲得產物海藻糖合成酶片段，測序得到核苷酸序列。根據測序結果設計的引物成功擴增出灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶DNA片段，電泳結果(圖1)顯示在1.7 kb左右有明顯條帶，條帶長度與預期的海藻糖合成酶基因大小符合。該片段含有1個開放閱讀框，編碼572個氨基酸。

圖1 Tres基因PCR產物凝膠電泳分析Fig.1 Electrphoresis of PCR products of tres gene

Blast分析顯示該序列與發布的玫瑰鏈霉菌(Streptosporangium roseum)的海藻糖合成酶同源性為80%。使用 SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線對氨基酸序列進行分析顯示，Tres為胞內酶，沒有信號肽。Compute Pi/Mw(http://web.expasy.org/cbi-bin/compute_pi/pi_tool)分析顯示Tres理論等電點為4.86。

2.2 重組海藻糖合成酶SDS-PAGE凝膠電泳分析

重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達9 h，轉化子發酵液上清液進行SDS-PAGE凝膠電泳分析(圖2)，空質粒 pET28a轉化大腸桿菌BL21(DE3)發酵液上清作為對照，結果顯示在66 kDa得到明顯的條帶，且目的蛋白大多集中在上清液中，超聲破碎沉淀中目的蛋白含量相對很少。該蛋白質分子量與核酸序列推測所得的理論分子質量66 kDa相符，表明重組質粒pET28a-tres在大腸桿菌中表達成功，且大部分目的蛋白以可溶性蛋白存在。

圖2 重組菌發酵表達產物SDS-PAGE檢測分析Fig.2 SDS-PAGE anlysis of recombinant trehalose synthase

2.3 重組海藻糖合成酶工程菌發酵條件優化

2.3.1 自誘導發酵和IPTG誘導發酵比較

取超聲破碎粗酶液30℃恒溫催化0.15 mol/L的麥芽糖1.5 h。IPTG誘導12h獲得的粗酶液中海藻糖合成酶催化酶活為0.83×104U/mL，自誘導發酵12 h獲得的粗酶液中海藻糖合成酶催化酶活為1.00×104U/mL。以本實驗中酶活力最高者作為100%，繪制相對酶活曲線(圖3)。結果顯示，自誘導培養較IPTG誘導培養，海藻糖合成酶的催化酶活提高了20.48%，說明采用乳糖作為誘導劑的自誘導發酵能有效提高重組大腸桿菌海藻糖合成酶活性。亦有文獻報道，以乳糖為誘導劑的自誘導培養基無論在產出蛋白的質量還是數量上都比傳統方法有很大提高［13］。

圖3 自誘導發酵和IPTG誘導發酵比較Fig.3 The comparison of auto-induction fermentation and fermentation induced by IPTG

2.3.2 自誘導發酵培養溫度的優化

自誘導發酵較傳統的IPTG誘導發酵，目的蛋白產量有所提高，接下來的實驗主要針對自誘導發酵進行研究，其中培養溫度對微生物生長、產物合成及代謝的影響尤為顯著［13］。選擇37、30、25℃三個溫度，分別于 10、12、14、16、19、21 h 取樣測定酶活(圖 4)。結果顯示，30℃自誘導培養19 h海藻糖合成酶催化酶活最高，達到1.24×104U/mL。

2.4 兩階段溫度控制培養條件的優化

2.4.1 最適兩階段溫度控制培養條件

圖4 溫度對自誘導發酵酶活的影響Fig.4 Effect of the temperature on the activity of recombinant enzyme by auto-induced fermentation

既然溫度對重組菌產酶有明顯的作用，本研究采用兩階段溫度調控策略，先在37℃下培養增加菌體量，然后低溫培養減緩重組蛋白的合成速率以促進蛋白正確折疊［14］。37 ℃培養2.5 h，30、25 ℃繼續培養10、12、14、16、19、21h，取樣測酶活(圖 5)，30 ℃恒溫培養作為對照。結果顯示，兩階段溫度控制最適培養條件為:37℃培養2.5 h，25℃繼續培養，最高酶活達到1.26×104U/mL，較30℃恒溫培養提高了0.96%。

圖5顯示，37℃培養2.5 h，菌體快速生長，較快進入產酶期，提高了發酵的生產強度。降至25℃有利于重組蛋白的正確折疊。兩階段溫度控制策略提高了海藻糖合成酶的合成能力，發酵10～18 h都有較高的酶活。

圖5 兩階段溫度對自誘導發酵酶活的影響Fig.5 Effect of the two-stage temperature on the activity of recombinant enzyme by auto-induced fermentation

2.4.2 添加小分子物質

本文將有效劑量的乙醇添加到細菌生長后期，提高目的蛋白的可溶性。37℃培養2.5 h，25℃繼續培養，穩定后期14 h時添加3%乙醇，不添加乙醇作為對照，分別取樣測定酶活，結果顯示，添加乙醇有助于可溶性目的蛋白濃度的提高(圖6)，催化酶活較對照提高了2.68%。

圖6 乙醇對可溶性目的蛋白濃度的影響Fig.6 The influence of ethanol on the concentration of soluble protein

本實驗在重組大腸桿菌穩定期后期添加3%的乙醇，改變了培養環境的滲透壓，增加了蛋白表達量，同時乙醇誘導分子伴侶的表達，進而提高可溶性目的蛋白的產量，結果顯示海藻糖合成酶催化麥芽糖酶活為:1.29×104U/mL，較最初提高了55.25%。該酶進行全細胞轉化30%的麥芽糖，24 h轉化率可達70%以上，生成海藻糖濃度約21%(w/v)(圖7)。

圖7 麥芽糖轉化生產海藻糖液相圖譜Fig.7 HPLC results for maltose and trehalose production

3 討論

本文構建了含有灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶基因的重組大腸桿菌BL21(DE3)。大腸桿菌表達系統作為一種成熟的原核表達系統，已廣泛應用于重組蛋白的外源表達，lac及其衍生的啟動子常被用來裝配到表達載體中，需要IPTG作為誘導劑，誘導目的蛋白的表達，但傳統誘導劑IPTG因其價格昂貴和潛在的毒性不適用于大規模生產，且各國皆不提倡使用。乳糖作為誘導物替代IPTG的報道已有很多，對海藻糖合成酶重組菌自誘導培養和LB培養的對比，乳糖誘導在最終菌體密度和目的蛋白產量均有較大提高。

溫度對微生物細胞生長、產物合成及代謝的影響是多方面的，不僅可以改變培養基的性質，而且會影響細胞代謝過程中各種關鍵酶的活性，因此在發酵過程中必須保證穩定且合適的外界環境。兩階段溫度調控研究結果表明，在海藻糖合成酶重組菌自誘導發酵過程中，采用變溫培養模式較單一溫度培養模式，重組酶表達量和酶活都有明顯提高。水溶性烷醇乙醇不僅可以促進細菌培養后期生長，且乙醇可以調節蛋白質極性，增加蛋白質折疊，在促進目的蛋白的可溶性表達方面具有明顯作用。

［1］ Ohtake S，Wang Y.Trehalose:current use and future applications［J］.Journal of Pharmaceutical Sciences，2011，100(6);2 020-2 053.

［2］ 黃日波.海藻糖:21世紀的新型糖類［M］.北京:化學工業出版社，2010:30-40.

［3］ 吳秀麗，岳明，丁宏標.海藻糖合酶的研究進展［J］.微生物學通報，2009，36(7):1 067-1 072.

［3］ Studier F.Protein Production by auto-induction in highdensity shaking cultures［J］.Protein Expression and Purification，2005，41:207-234.

［4］ YU S，WANG Y，LIU Y，et al.Expression and purification of APRIL by auto-induction［J］.Protein Expression and Purification，2009，68(1):49-53.

［5］ 朱至，廖鮮艷，紀凱，等.兩階段溫度控制策略提高Lactobacillus kefiranofaciens發酵生產 Kefiran［J］.過程工程學報，2008，8(1);144-147.

［6］ Conrady D，Brescia C，Horii K，et al.A zinc-dependent adhesion module is responsible for intercellular adhesion in staphylococcal biofilms ［J］.Processdings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，109(49):19 456-19 461.

［7］ Ingram L，Dickens B，Buttke T.Reversible effects of ethanol on E.coli［J］.Advances in Experimental Medicine and Biology，1980，126(02):299-337.

［8］ Ben-Bassat A，Dorin G，Bauer K.Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria［P］.European:85103560.0.1985.02.10.

［9］ Sambrook J，Russell D.分子克隆實驗指南［M］.北京:科學出版社，2008:附錄2.

［10］ Grabski A，Mehler M，Drott D.The overnight express autoinduction system:high-density cell growth and protein expression while you sleep［J］.Nature Methods，2005，2(3):233-235.

［11］ 楊懷濤，楊秀英.檢測HPV的新策略—簡并引物PCR［J］.國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊，1994，15(2):71-73.

［12］ JIANG L，LIN M，ZHANG Y，et al.Identification and characterization of a novel trehalose synthase gene derived from saline-alkali soil metagenomes［J］.Plos One，2013，8(10):1-11.

［13］ 聶堯，徐巖，陳文波.一種應用自誘導培養基和雙溫度調控策略生產胞外普魯蘭酶的方法［P］.中國:201210187066.7.2012.06.08.

［14］ ZHANG F，HUA Z，CHENG J，et al.Effect of two-staged temperature strategy on production of cutinase with recombinant Bacillus subtilis［J］.Chinese Journal of Applied and Environmental Biology，2009，15(5):730-733.