蚌肉鹽溶蛋白提取工藝優(yōu)化及其功能特性研究*

王伯華，雷頌，劉玉嬌，李梅，楊品紅

(湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，湖南常德，415000)

河蚌，又名河歪、河蛤蜊等，屬軟體動物門瓣鰓綱蚌科，是一種普通的貝殼類水生動物。據(jù)《本草綱目》記載，河蚌肉對人體有清熱解毒、滋陰平肝、明目防眼疾等保健功效。我國河蚌資源十分豐富，但蚌肉的精深加工尚未形成規(guī)模，尤其是珍珠采收后的蚌肉大部分未能進(jìn)一步加工而當(dāng)作廢料處理，不僅造成資源浪費，而且嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境。市場上由河蚌副產(chǎn)物生產(chǎn)的產(chǎn)品，多為粗加工、低技術(shù)含量的飼料和肥料及工藝制品，并且供求已接近飽和，而高技術(shù)附加值的產(chǎn)品尚未在市場形成規(guī)模。

蚌肉可作為一種蛋白質(zhì)生產(chǎn)原料，也可為酶解河蚌蛋白制備具有生理功能的肽類提供物質(zhì)基礎(chǔ)［1］。蛋白質(zhì)的功能特性指的是乳化、黏結(jié)、凝膠作用等在食品中起著重要作用的物理化學(xué)性質(zhì)。其對食品的感官質(zhì)量及質(zhì)地結(jié)構(gòu)均有較大影響［2］。貝類肌原纖維蛋白質(zhì)在加工特性上與其他肌肉肌原纖維蛋白類似，其熱誘導(dǎo)凝膠性能影響著肉糜制品的黏著力、保水性、彈性、質(zhì)構(gòu)等產(chǎn)品品質(zhì)［3］。有研究表明，僅0.5%的肌原纖維蛋白經(jīng)熱誘導(dǎo)就足以產(chǎn)生凝膠，而其他蛋白質(zhì)含量須達(dá)10%左右時才能形成凝膠［4］。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

河蚌肉:購買體長約80～100 mm的新鮮三角帆蚌，將其剖開，取出外套膜和蚌肉，用4℃冰水清洗3次后置于豆?jié){機(jī)中絞碎，碎肉裝入樣品袋中于-18℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

新鮮豬肉、白砂糖、食鹽、大豆油、味精、雞蛋、香辛料，市售;牛血清白蛋白，Sigma公司;PVDC腸衣，河北雄縣鴻達(dá)包裝制品有限公司;小麥蛋白，浚縣天龍面業(yè)有限公司;大豆蛋白，谷神生物科技股份集團(tuán)有限公司;玉米變性淀粉，長春大華淀粉有限公司;卡拉膠，青島德慧海洋生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

NaOH、NaCl、KI、無水 CuSO4、酒石酸鉀鈉、H2SO4、HCl等，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.3 儀器設(shè)備

A-88組織搗碎勻漿機(jī)，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;ZB20斬拌機(jī)，嘉信食品機(jī)械有限公司;S-25數(shù)顯pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;AL204電子分析天平，梅特勒-托麗多儀器有限公司;LD4-2A低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;721可見光分光光度計，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;DZF-6050真空干燥箱，金壇市榮華儀器制造有限公司;FW100萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司;HH-S4恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司;BCD-265CMX冰箱，合肥美的榮事達(dá)冰箱有限公司。

1.4 蚌肉鹽溶性蛋白的提取方法

將冷凍河蚌肉在4℃下解凍，加入4倍質(zhì)量0～4℃的蒸餾水，用高速組織搗碎勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理(6 000 r/min，5 min)。再轉(zhuǎn)入離心管中，離心(3 000 r/min，10 min)，去除上清液，重復(fù)1次，向沉淀中加入不同提取條件的NaCl溶液，充分?jǐn)噭蛟?℃ 靜置20 h后，取出勻漿液，再經(jīng)(4 000 r/min，30 min)離心后所得上層溶液即為鹽溶蛋白質(zhì)溶液［5］。

1.5 蛋白質(zhì)含量的測定

采用雙縮脲法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。

1.6 蚌肉鹽溶蛋白提取工藝的優(yōu)化

1.6.1 單因素試驗

鹽濃度對鹽溶蛋白得率的影響，取鹽濃度(mol/L)為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 五個梯度進(jìn)行試驗;固液比對鹽溶蛋白得率的影響，取固液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 五個梯度進(jìn)行試驗;浸提時間對鹽溶蛋白得率的影響，取浸提時間(h)為 8、12、16、20、24 五個梯度進(jìn)行試驗;浸提pH對鹽溶蛋白得率的影響，取浸提 pH 值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 五個梯度進(jìn)行試驗。

1.6.2 正交試驗確定最佳提取條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取鹽濃度、固液比、浸提pH、浸提時間四項主要影響因素作為考察因素，依據(jù)L9(34)正交試驗表進(jìn)行4因素3水平正交試驗，以確定提取蚌肉鹽溶蛋白的最佳工藝參數(shù)。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels for the orthogonal test

1.7 蚌肉鹽溶性蛋白功能特性的研究方法

1.7.1 溶解性的測定方法

配制2.5 g/100 mL蚌肉鹽溶性蛋白樣品溶液各20 mL，分別調(diào)節(jié) pH 值至 4、5、6、7、8、9，室溫振蕩 40 min后，以4 000 r/min離心分離30 min，測定上清液中蛋白質(zhì)含量，用上清液中蛋白質(zhì)量占樣品中總蛋白質(zhì)量的百分比表示溶解度［6］。

1.7.2 持水性(WA)的測定方法

稱取0.5 g蚌肉鹽溶性蛋白樣品置于50 mL離心管中，加入5 mL蒸餾水使樣品完全浸濕，充分混勻1 min后，在室溫下靜置30 min，于2 100 r/min離心10 min。離心后，去除上清液，稱重。若沒有上清液，則應(yīng)繼續(xù)加水、混勻、再離心，至離心后有少量上清液為止。按下式計算持水性［7］。

式中:m，樣品質(zhì)量，g;m1，離心管和樣品質(zhì)量，g;m2，離心管和沉淀物質(zhì)量，g

1.7.3 持油性(FA)的測定方法

稱取0.5 g蚌肉鹽溶性蛋白樣品置于50 mL離心管中，加入5 mL大豆油混勻1 min后，在室溫下靜置30 min，于3 000 r/min離心20 min，吸去上層油后稱重。按下式計算持油性［7］。

式中:F，樣品重量，g;F1，離心管和樣品質(zhì)量，g;F2，離心管和沉淀物質(zhì)量，g

1.7.4 起泡能力(FC)及泡沫穩(wěn)定性(FS)的測定方法

100 mL不同濃度樣品溶液，攪拌20 min后調(diào)節(jié)pH值，轉(zhuǎn)入勻漿機(jī)高速(10 000 r/min)攪打2 min后，迅速轉(zhuǎn)入500 mL量筒，讀取泡沫體積(V0)。靜置30 min后，讀取泡沫體積(Vr)，按下式計算起泡能力和泡沫穩(wěn)定性［6］。

1.7.5 乳化能力(EC)及乳化穩(wěn)定性(ES)的測定方法

取25 mL不同濃度樣品溶液勻漿30 s，加入25 mL大豆油并攪勻，繼續(xù)勻漿2 min后轉(zhuǎn)入刻度離心管，以3 000 r/min離心10 min，記錄體積。另取同法制得混合液于80℃保溫40 min，冷卻至室溫后離心，記錄體積。按下式計算乳化能力和乳化穩(wěn)定性［6-7］。

1.7.6 凝膠形成與保水性測定方法

將鹽溶蛋白溶液置于干凈離心管中，然后于水浴鍋中加熱，從20℃ 緩慢升溫到70℃(1℃/min)，并在設(shè)定溫度下恒溫5 min，形成的凝膠用自來水冷卻30 min，置于4℃下保存24 h，然后測定保水性。

凝膠保水性的測定:先稱離心管質(zhì)量m，將鹽溶蛋白放在離心管中制備凝膠，在4℃下保存24 h，稱離心管和蛋白質(zhì)量m1，然后將凝膠在1 000 r/min、4℃下離心10 min，稱傾去水分后的管和凝膠的質(zhì)量m2，按下式計算凝膠保水性［8］。

1.8 蚌肉鹽溶性蛋白在西式香腸中的初步應(yīng)用

1.8.1 工藝流程

1.8.2 西式香腸配方及操作要點

參照周光宏［8］的西式香腸配方及操作要點進(jìn)行試驗。

1.8.3 產(chǎn)品的感官評價

用蚌肉鹽溶蛋白替代原大豆蛋白，添加到西式香腸配方中，將其與添加大豆蛋白制成的西式香腸進(jìn)行比較。感官評價小組由20人組成，分別從形態(tài)色澤、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、香氣滋味、彈性、折曲性試驗五個方面對西式香腸進(jìn)行評價。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 西式香腸感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory analysis of western sausage

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，雙縮脲法測定鹽溶蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.079 4x+0.000 6，其 R2=0.999 9，具有較好的擬合度，可用于后續(xù)試驗。

圖1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein content standard curve

2.2 鹽溶蛋白提取單因素試驗

2.2.1 鹽溶液濃度對提取鹽溶蛋白的影響

在提取時間(20 h)、固液比(1∶4)、pH 7.4的條件下，用不同濃度的NaCl溶液提取鹽溶蛋白，結(jié)果如圖2所示。NaC1濃度在0.4～0.5 mol/L內(nèi)，蛋白得率隨鹽濃度的增加而增加，說明在這個范圍內(nèi)較高的鹽溶度能提高鹽溶蛋白的浸出率;鹽濃度在0.5～0.8 mol/L內(nèi)，蛋白得率隨鹽濃度的增加而趨于減少，說明在這個范圍內(nèi)過高的鹽濃度反而抑制了鹽溶蛋白的析出;NaC1濃度為0.5 mol/L時提取率最高。也有研究表明，雖然高濃度的鹽溶液可以提高蛋白的提取率，但是當(dāng)鹽溶度高于0.7 mol/L時，熱凝時蛋白會形成較粗糙的凝膠，降低凝膠濃度［9-10］。

圖2 鹽濃度對鹽溶蛋白提取量的影響Fig.2 Effects of salt concentration on salt soluble protein yield

2.2.2 固液比對提取鹽溶蛋白的影響

在鹽濃度0.5 mol/L、浸提時間20 h、浸提 pH 7.4的條件下，采用不同固液比提取鹽溶蛋白。由圖3可看出，提取液的蛋白總量在固液比1∶2～1∶4之間增幅顯著，1∶4～1∶6時則相對緩慢，說明在固液比為1∶4時，鹽溶蛋白已經(jīng)能夠較好的浸出。因此，在要求提取液的鹽溶蛋白濃度和濃度總量盡可能高的情況下選用固液比1∶4進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2.3 浸提時間對提取鹽溶蛋白的影響

圖3 固液比對鹽溶蛋白提取量的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio onsalt soluble protein yield

在NaC1濃度為0.5 mol/L、固液比1∶4、提取 pH 7.4的條件下，考察了不同提取時間對鹽溶蛋白提取量的影響。由圖4可知，在8～20 h時，隨著提取時間的延長，鹽溶蛋白提取量增加，而20 h后，蛋白質(zhì)得率增加幅度緩慢。這是因為提取時間達(dá)到20 h后，可溶于NaCl溶液的蛋白幾乎全部溶出。考慮到提取時間過長可能會使部分蛋白變性，不利于后期試驗，而且長時間提取也會增大提取成本，所以選擇提取時間為20 h進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖4 浸提時間對鹽溶蛋白提取量的影響Fig.4 Effects of extraction time onsalt soluble protein yield

2.2.4 pH值對鹽溶蛋白提取的影響

在 NaCl濃度 0.5 mol/L、固液比 1∶4、提取時間為20 h的條件下，考察了不同pH對鹽溶蛋白提取的影響。由圖5可知，pH值為5時，提取的鹽溶蛋白含量最少，主要是因為肌原纖維蛋白的等電點在pH 5附近，蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，影響了鹽溶蛋白提取量。隨著pH值的升高，肌原纖維蛋白所帶的同種電荷增多，由于同種電荷的相互排斥作用，使其更易在較高離子強(qiáng)度下溶解析出［11］，在pH值為8時，鹽溶蛋白含量達(dá)到最大。

2.3 鹽溶蛋白提取正交試驗結(jié)果與分析

通過正交試驗確定最佳鹽溶蛋白提取工藝條件，根據(jù)極差R的大小進(jìn)行因素的水平變化對試驗影響的主次排序。R越大，表示該因素的水平變化對試驗影響越大。反之，R越小，則該因素的水平變化對試驗影響越小。通過表3可知，蚌肉鹽溶蛋白提取的最佳工藝條件為A3B2C2D3，即提取液中NaCl濃度為0.7 mol/L、固液比為1∶4、pH值為7、浸提時間為24 h。4個因素中，對試驗的影響大小順序為A＞B＞C＞D，表明鹽濃度對試驗的值影響最大，其次為固液比和pH值，浸提時間對試驗的影響最小。

圖5 pH對鹽溶蛋白提取量的影響Fig.5 Effects of pH onsalt soluble protein yield

表3 正交試驗表Table 3 Results of the orthogonal test

極差分析法是一種初步的分析法，不能估計試驗誤差的大小，也不能區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)的波動是由因素水平變化引起的還是由試驗誤差引起，因此在極差分析的基礎(chǔ)上，對數(shù)據(jù)作了進(jìn)一步的方差分析，這樣找到的最佳提取條件較單用正交試驗分析更準(zhǔn)確［12］。從正交試驗及方差分析結(jié)果來看，兩者一致顯示蚌肉鹽溶蛋白最佳提取工藝條件為:鹽濃度0.7 mol/L、固液比1∶4，pH值7、浸提時間24 h。因試驗所選取的因素水平已經(jīng)過了單因素試驗的優(yōu)化，方差分析亦顯示因素各水平間差異不顯著。

表4 正交試驗方差分析表Table 4 Variety analysis of the results

雖然正交設(shè)計的試驗點不一定包括了全面實驗的最優(yōu)實驗組合，但是通過對正交試驗的分析能找出試驗點以外的最優(yōu)處理組合。因本試驗中找出的最優(yōu)水平組合A3B2C2D3并未出現(xiàn)在正交表中，因此重新按最佳組合進(jìn)行試驗。測得在此最佳條件下鹽溶蛋白提取量為2.925 g，大于組合A3B3C2D1，與正交表結(jié)果相符。

2.4 蚌肉鹽溶性蛋白的功能特性

2.4.1 溶解性

蛋白質(zhì)的溶解性是指蛋白質(zhì)分子和水分子之間產(chǎn)生相互作用的綜合結(jié)果［8］。蛋白質(zhì)的一些功能特性，如增稠、起泡、乳化和凝膠等特性均與溶解性有關(guān)［3］。pH值對蚌肉鹽溶蛋白溶解性的影響如圖6所示。

圖6 pH值對蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白溶解性的影響Fig.6 Effects of pH on solubility of mussel meat salt soluble protein and soybean protein

隨著pH值的增加，蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白的溶解性均有所增加，且大豆蛋白的溶解性增加幅度大于蚌肉鹽溶蛋白。可見，大豆蛋白溶解性優(yōu)于蚌肉鹽溶蛋白。由于肉糜和重組肉制品中的凝膠、乳化、保水性作用就是溶解了的蛋白質(zhì)和肉的各種成分相互作用的結(jié)果。因此，蛋白質(zhì)的溶解性在肉的加工中有特殊的重要性［13］。在肉糜制品加工配方中應(yīng)充分考慮蚌肉鹽溶性蛋白的溶解性，使其具有更好的功能特性。

2.4.2 持水性(WA)和持油性(FA)

蛋白質(zhì)的持水性是指將一定濃度的蛋白質(zhì)水溶液離心，其中殘留的水分含量［9］。蛋白質(zhì)的持油性是指蛋白質(zhì)對游離脂肪的結(jié)合和保持能力，能改善食品的口感和風(fēng)味［6］。蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白的持水性和持油性的比較如圖7所示。蚌肉鹽溶蛋白的持水性為3.0 g/g，蛋白質(zhì)結(jié)合的水分子較多，說明蚌肉鹽溶蛋白分子表面的親水基團(tuán)較多;其持油性為2.2 g/g，與大豆蛋白相比有更強(qiáng)的持油性，說明蚌肉鹽溶蛋白表面的親脂基團(tuán)與脂類的結(jié)合能力更大［6］。肉糜制品加工中，水可以促進(jìn)蛋白質(zhì)與較強(qiáng)極性的風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合，脂類的存在有助于羰基風(fēng)味物結(jié)合能力的增加［4］。蚌肉鹽溶蛋白較高的持水性和持油性特征有利于肉糜制品風(fēng)味的形成。

圖7 蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白的持水性和持油性的比較Fig.7 Comparison of WA and FA between mussel meat salt soluble protein and soybean protein

2.4.3 起泡能力(FC)及泡沫穩(wěn)定性(FS)

起泡性質(zhì)通常是指蛋白質(zhì)在氣液界面形成堅韌的薄膜，使氣體進(jìn)入并維持一定穩(wěn)定狀態(tài)的能力［14-15］。蛋白濃度對蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白FC和FS的影響如圖8和圖9所示。

圖8 蛋白濃度對蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白起泡能力的影響Fig.8 Effect of protein concentration on FC of mussel meat salt soluble protein and soybean protein

圖9 蛋白濃度對蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of protein concentration on FS of mussel meat salt soluble protein and soybean protein

蚌肉鹽溶蛋白質(zhì)的起泡能力隨蛋白濃度的變化不明顯，在蛋白濃度為0.6%時最高，0.2% ～0.6%隨蛋白濃度的增加起泡能力增強(qiáng);而蚌肉鹽溶蛋白的泡沫穩(wěn)定性在0.2%～0.6%隨蛋白濃度的增加而減弱。與大豆蛋白相比，蚌肉鹽溶蛋白的起泡能力稍低，而泡沫穩(wěn)定性更高。

2.4.4 乳化能力(EC)及乳化穩(wěn)定性(ES)

影響蛋白質(zhì)乳化性質(zhì)的因素有很多，如pH、溫度、蛋白質(zhì)類型和離子強(qiáng)度等內(nèi)在因素;制備乳液的設(shè)備情況和乳化剪切速度等外在因素［16-17］。蛋白濃度對蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白EC和ES的影響如圖10和圖11所示。蛋白濃度變化對蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白的乳化能力影響不大，蚌肉鹽溶蛋白在濃度為0.4%時乳化能力最佳，整體而言蚌肉鹽溶蛋白的乳化能力優(yōu)于大豆蛋白。蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白在不同的蛋白濃度下都表現(xiàn)出良好的乳化穩(wěn)定性。肉糜中蛋白質(zhì)基質(zhì)的形成能固定自由水，減少熱處理時水分的丟失，從而穩(wěn)定成品結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)基質(zhì)還能包裹固定住肉糜中的脂肪顆粒，防止其在加熱時融化流失［13］。可見蚌肉鹽溶性蛋白良好的乳化能力和乳化穩(wěn)定性對肉制品加工極其重要。

圖10 蛋白濃度對蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白乳化能力的影響Fig.10 Effect of protein concentration on EC of mussel meat salt soluble protein and soybean protein

圖11 蛋白濃度對蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白乳化穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of protein concentration on ES of mussel meat salt soluble protein and soybean protein

2.4.5 凝膠保水性(WHC)

蛋白濃度對蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白凝膠保水性的影響如圖12所示。隨著蛋白濃度的增加，蚌肉鹽溶蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)凝膠保水性均上升，但蛋白濃度低于1.0%時，蚌肉鹽溶蛋白的凝膠保水性不如大豆蛋白。凝膠可以黏附肉糊制品中的肉顆粒，形成三維空間網(wǎng)絡(luò)來穩(wěn)定乳化的脂肪團(tuán)粒，且能夠捕獲風(fēng)味物質(zhì)和其他成分，還可形成復(fù)雜的毛細(xì)管系統(tǒng)來保持水［18-19］。可見蛋白凝膠和一系列肉制品的質(zhì)量特征有關(guān)［3］。因此，當(dāng)蚌肉鹽溶蛋白應(yīng)用于肉糜制品時，應(yīng)注意其使用量，也可以添加部分高凝膠強(qiáng)度的蛋白質(zhì)或其他添加劑來保證肉制品的風(fēng)味及質(zhì)地。

圖12 蛋白濃度對蚌肉鹽溶蛋白和大豆蛋白凝膠保水性的影響Fig.12 Effect of protein concentration on WHC of mussel salt soluble protein and soybean protein

2.5 蚌肉鹽溶蛋白在西式香腸中的初步應(yīng)用

嘗試將蚌肉鹽溶蛋白替代大豆蛋白制備西式香腸，將兩者進(jìn)行感官評價。蚌肉鹽溶蛋白西式香腸平均得分為89分，大豆蛋白西式香腸為92分，說明兩者在形態(tài)色澤、香氣滋味、彈性等方面均無較大差異。初步可知，蚌肉鹽溶蛋白添加到西式香腸中替代大豆蛋白是可行的。

3 結(jié)論

各因素對蚌肉鹽溶蛋白提取量的影響程度依次是NaCl濃度＞料液比＞pH＞浸提時間，確定了蚌肉鹽溶蛋白質(zhì)提取的最佳工藝條件為NaCl濃度0.7 mol/L，提取時間 24 h，固液比 1∶4，提取液 pH值7。在此條件下，提取鹽溶蛋白量最大為117 mg/g。對蚌肉鹽溶蛋白功能特性的研究表明，與大豆蛋白相比，蚌肉鹽溶蛋白的持水性、持油性較高，溶解性和凝膠保水性稍低，而乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性相差不大。總體而言，蚌肉鹽溶蛋白具有良好的功能特性。將其替代大豆蛋白制作西式香腸，在形態(tài)色澤、風(fēng)味、彈性等方面均無明顯差異。

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