響應(yīng)面優(yōu)化大孔吸附樹脂分離純化茼蒿總黃酮*

陳建中，葛水蓮，昝立峰，王更先，邢浩春，付靜

1(邯鄲學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北邯鄲，056005)2(冀南太行山區(qū)野生資源植物研發(fā)中心，河北邯鄲，056005)

研究表明，黃酮類物質(zhì)具有抗癌、抗病毒，調(diào)節(jié)免疫力、治療心腦血管疾病、骨質(zhì)疏松和糖尿病并發(fā)癥等多種生理活性藥用作用［1-2］。茼蒿(Chrysanthemum coronarium L.)又名蓬蒿，是菊科茼蒿屬1年或2年生草本植物。其莖葉可作為蔬菜食用，亦可入藥。《中藥大辭典》記載，茼蒿有“和脾胃、消痰飲、安心神”之功效，性味甘、辛、平，無毒，清利頭目，利小便［3］。

大孔吸附樹脂具有比表面積較大、吸附純化效率高、物理吸附污染低、溫度穩(wěn)定性高等特點(diǎn)［4-5］。因而近幾年在中草藥有效成分提取和天然產(chǎn)物的分離純化中被廣泛應(yīng)用［6-7］。有關(guān)茼蒿總黃酮(TFC)純化工藝的研究并不多見，試驗(yàn)以TFC的吸附量和回收率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)考察5種大孔吸附樹脂對(duì)TFC的靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附和解吸附性能，以篩選大孔樹脂純化TFC的最佳工藝。

1 材料方法

1.1 材料試劑儀器

材料:茼蒿于開花前采集地上部分，采時(shí)株高多20～40 cm，為冀南太行山區(qū)野生種類，采集地上部分。材料去掉雜質(zhì)、洗凈塵土、瀝干水分，再于60℃鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒重，粉碎過40目篩后備用。

試劑:無水乙醇、蘆丁、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等均為分析純。

試驗(yàn)儀器及設(shè)備:小型自動(dòng)粉碎機(jī)(鄭州市烽火機(jī)械設(shè)備有限公司)，L5紫外可見分光光度計(jì)(日本島津儀器公司)，N-1100V-WP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(西安安泰儀器公司)。

1.2 標(biāo)曲繪制與TFC濃度測(cè)定

標(biāo)曲繪制:參考江敏［8］、田徽［9］等人的方法，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出，吸光度(Y)和濃度(X)的回歸方程:Y=9.12X-0.023，R2=0.998 6，線性回歸關(guān)系良好。黃酮含量測(cè)定:吸取樣品液1 mL，用體積分?jǐn)?shù)(下同)70%乙醇補(bǔ)至5 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5%NaNO20.3 mL，搖勻置6 min;再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al(NO3)30.3 mL，搖勻置6 min;加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH 4 mL，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻15 min后測(cè)定吸光度，重復(fù)3次求均值［10］。

1.3 大孔吸附樹脂靜態(tài)分離純化試驗(yàn)

1.3.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

取樹脂適量，95%乙醇完全浸泡24 h，去除大孔樹脂碎片及雜物。采用濕法裝柱，用95%乙醇反復(fù)洗滌，直至水與流出液不產(chǎn)生白色渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味;接著先后用體積分?jǐn)?shù)5%的HCl與質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的NaOH反復(fù)淋洗，并靜止置2～4 h后，用蒸餾水洗至pH值中性，浸泡于蒸餾水中備用。

1.3.2 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附-解吸性能試驗(yàn)

在25℃下精確稱取經(jīng)預(yù)處理的5種大孔樹脂5.00 g，分別置于250 mL磨口三角錐形瓶中，精密加入濃度2.56 mg/mL的 TFC100 mL，每隔15 min振搖20 s持續(xù)2 h，使其充分吸附至吸附平衡，精密移取剩余樣液適量測(cè)定其吸光度值，計(jì)算吸附前后黃酮質(zhì)量濃度的變化;將吸附至飽和狀態(tài)的樹脂另置于250 mL錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，每隔10 min振搖20 s，振搖2 h，精密吸取上層液測(cè)定吸光度值，計(jì)算各樹脂的吸附量，解吸附率和回收率。

吸附量/(mg·g-1)=(c0-c1)V/M

吸附率/%= ［(c0-c1)/c0］×100

解吸率/%=［c2/(c0-c1)］×100

回收率/%=(c2/c0)×100

式中:c0為吸附液中黃酮質(zhì)量濃度，mg/L;c1為吸附后溶液黃酮質(zhì)量濃度，mg/L;c2為解吸液中黃酮質(zhì)量濃度，mg/L;M為干樹脂的吸附量，mg/L;V為吸附液體積，mg/L［11］。

1.4 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸性能優(yōu)化試驗(yàn)

1.4.1 大孔樹脂上樣液的泄露曲線測(cè)試

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的大孔樹脂5.00 g進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，取上樣溶液黃酮濃度為2.56 mg/mL，以1 mL/min的流速上樹脂柱。分段收集流出液，每份10 mL，收集30份，以編號(hào)為橫坐標(biāo)，以黃酮含量為縱指標(biāo)，繪制泄漏曲線，流出液中黃酮濃度達(dá)到上柱液濃度的10%時(shí)，稱為泄漏點(diǎn)，當(dāng)流出液中黃酮濃度達(dá)到上柱液濃度的100%時(shí)，稱為飽和點(diǎn)［12］。

1.4.2 上樣質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附的影響

取7份2.56 mg/mL的TFC提取液，加水稀釋至0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 和 2.00 mg/mL，分別加入D-101樹脂柱，以1.0 mL/min的流速通過，95%乙醇洗脫，測(cè)定流出液中黃酮濃度。

1.4.3 上樣液pH對(duì)樹脂吸附的影響

取6份1.00 mg/mL的TFC 50 mL，分別用酸或堿將 pH 值調(diào)至 4、5、6、7、8、9，分別加入 6 根 D-101樹脂柱，以1.0 mL/min的流速過柱吸附，95%乙醇溶液進(jìn)行反復(fù)洗脫，測(cè)定流出液的黃酮含量。

1.4.4 大孔樹脂洗脫曲線的測(cè)定

稱取經(jīng)預(yù)處理的D-101大孔樹脂5.00 g，取已知質(zhì)量濃度的黃酮溶液以1 mL/min的流速通過進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，待樹脂達(dá)到完全吸附平衡后，用95%的乙醇以以2 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，每份收集10 mL，分段測(cè)定洗脫液中黃酮含量，繪制洗脫曲線［13］。

1.4.5 大孔樹脂洗脫劑濃度對(duì)解吸附的影響

取5份質(zhì)量濃度0.50 mg/mL TFC提取液各50 mL，分別加入5根D-101樹脂柱，以1.0 mL/min的流速吸附，用55%，65%，75%，85%，95%的乙醇洗脫，測(cè)定流出液其中黃酮含量［14］。

1.4.6 洗脫流速對(duì)大孔樹脂解吸附的影響

取質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL黃酮粗提液50 mL，加入D-101樹脂柱，以1.0 mL/min的流速通過后，各用95%乙醇以 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/min 進(jìn)行洗脫，測(cè)定流出液的黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂靜態(tài)和動(dòng)態(tài)解吸附性能測(cè)試

2.1.1 大孔吸附樹脂的篩選

試驗(yàn)測(cè)定5種性質(zhì)不同的樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸附試驗(yàn)，茼蒿黃酮的吸附量，解吸率和回收率數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

表1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附性能Table 1 Static adsorption properties of macroporous resins

從表1可以看出，TFC吸附量較大的是D-101和AB-8，其次是 DA-201，SD-401 和 DM-301，解吸附率最強(qiáng)的是D-101和AB-8，結(jié)合回收率數(shù)據(jù)，D-101樹脂吸附解吸附特性優(yōu)于其他樹脂。

2.1.2 D-101大孔樹脂泄露曲線測(cè)試

圖1表明，隨著進(jìn)樣液體積的增加，流出液中黃酮的濃度逐漸增加。當(dāng)上柱體積為60 mL時(shí)，流出液中黃酮濃度達(dá)到0.256 mg/mL，初始上樣液黃酮濃度的10%，為大孔吸附樹脂D-101的泄露點(diǎn)，所以上柱體積控制在60 mL為宜。當(dāng)上樣液體積逐漸增加，大孔吸附樹脂D-101的吸附量逐漸趨于飽和，當(dāng)樣液達(dá)到210 mL時(shí)，此時(shí)流出液黃酮濃度2.56 mg/mL已和上樣液相近，該體積為大孔吸附樹脂D-101的吸附量的飽和點(diǎn)。

圖1 D-101樹脂吸附茼蒿黃酮的泄露曲線Fig.1 Leakage curve of TFC on D-101

2.1.3 上樣濃度對(duì)D-101大孔樹脂吸附性能的影響

圖2所示，在低質(zhì)量濃度區(qū)間內(nèi)，隨著進(jìn)樣濃度的增加，樹脂吸附量和回收率都在增大，在進(jìn)樣濃度為1.00 mg/mL時(shí)，樹脂達(dá)到最大吸附量，之后吸附量基本上保持不變，但當(dāng)質(zhì)量濃度大于1.0 mg/mL后，樹脂回收率反而下降，這是因?yàn)檫M(jìn)樣質(zhì)量濃度大于樹脂的吸附飽和度造成。而且進(jìn)樣質(zhì)量濃度過高，將導(dǎo)致樹脂再生次數(shù)的增加，縮短樹脂使用周期，所以進(jìn)樣液初始質(zhì)量濃度1.00 mg/mL為宜。

圖2 上樣質(zhì)量濃度對(duì)D-101大孔樹脂吸附性能的影響Fig.2 Effect of concentration on adsorptionof D-101

2.1.4 上樣pH對(duì)D-101大孔樹脂吸附性能的影響

由圖3可知，TFC吸附量和回收率都隨pH變化明顯，當(dāng)pH值大于6時(shí)回收率大于吸附量，當(dāng)pH=6時(shí)回收率和吸附量都達(dá)到最大值，且隨著pH值繼續(xù)升高兩者都呈下降趨勢(shì)，當(dāng)pH≥7時(shí)，粗提液會(huì)出現(xiàn)沉淀。因此上樣液酸堿度選擇pH=6比較適宜。

圖3 上樣pH對(duì)D-101大孔樹脂吸附性能的影響Fig.3 Effect of pH on adsorption of D-101

2.1.5 D-101大孔樹脂洗脫曲線的測(cè)定

如圖4所示隨著洗脫劑用量的增加洗脫液中TFC濃度在不斷增加，當(dāng)洗脫劑為40 mL時(shí)，洗脫液TFC濃度達(dá)到極大值，隨著洗脫劑用量的增加，TFC濃度在逐漸降低，洗脫劑為80 mL時(shí)，黃酮含量降低至最低值，洗脫液中TFC不足0.01 mg/mL，說明大孔樹脂吸附的TFC基本被洗脫完畢。綜合考慮洗脫峰單一，對(duì)稱，尖銳，沒有明顯的拖尾現(xiàn)象，表明95%乙醇80 mL可將TFC完全洗脫下來。

圖4 D-101大孔樹脂的洗脫曲線Fig.4 Elution curve of D-101 macroporous resin

2.1.6 洗脫劑濃度對(duì)D-101解吸附性能的影響

由圖5可得，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)≤75%時(shí)，隨著體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率和回收率二者逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞75%時(shí)，二者皆呈下降趨勢(shì)。擁有多酚結(jié)構(gòu)和糖苷鍵的黃酮類化合物在水溶液中極性較弱，易被乙醇從樹脂中洗脫。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)太高時(shí)，將大部分雜質(zhì)也一起洗脫。因此確定洗脫劑遺傳的體積分?jǐn)?shù)75%為宜。

圖5 洗脫濃度對(duì)D-101大孔樹脂解吸附率的影響Fig.5 Effect ofeluent concentration on desorption rate of D-101

2.1.7 洗脫流速對(duì)D-101解吸附性能的影響

圖6 洗脫流速對(duì)D-101大孔樹脂解吸附性能的影響Fig.6 Effect ofelution flow speed on desorption rate of D-101

如圖6所示，隨著洗脫劑流速的增加，大孔樹脂的解吸率和回收率都在不同程度的下降，特別當(dāng)＞3 mL/min時(shí)，回收率較解吸率下降快速且明顯。當(dāng)洗脫速率1.0 mL/min時(shí)洗脫效果好，而在洗脫速率＞3.0 mL/min解吸率下降曲線平緩，而回收率下降明顯從63.25%下降到44.95%。綜合考慮生產(chǎn)周期和回收率確定洗脫速度2.0 mL/min為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)中心組合(Box-Benhnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，做四因素三水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(5個(gè)中心點(diǎn))的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。表2中29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類:一類是自變量A、B、C、D取值在各水平所構(gòu)成的三維析因點(diǎn)，共計(jì)24個(gè);一類是區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。A(上樣濃度，mg/mL)，B(上樣 pH)，C(洗脫濃度，%)，D(洗脫流速，mL/min)為自變量，TFC回收率為響應(yīng)值Y(指標(biāo)值)［15］。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 響應(yīng)面曲面方差分析

由表3分析可知，(P=0.047＜P=0.05)二次回歸方程模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.428＞P=0.05)。通過該模型的方差分析可知:上樣pH(B)對(duì)TFC回收率影響差異顯著(P=0.047)，而上樣濃度(A)、洗脫濃度(C)和洗脫速度(D)3個(gè)因素對(duì)TFC回收率影響差異不顯著。四因素對(duì)TFC回收率影響效應(yīng)的大小依次pH(B)＞上樣濃度(A)＞洗脫濃度(C)＞洗脫速度(D)。經(jīng)回歸模型擬合，四因子對(duì)響應(yīng)值Y的影響可用以下多元二次方程:

Y=63.31-0.72A-0.83B-0.14C-0.072D-0.71AB-0.053AC-0.7AD-0.41BC+0.54BD-0.21CD-2.500E-0.78A2-0.53B2-2.22C2-0.71D2

表3 響應(yīng)面曲面方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiment

2.2.3 兩因素交互影響回收率的響應(yīng)曲面分析

如圖7所示，回收率的響應(yīng)面開口向下，回收率Y和4個(gè)制約因素呈現(xiàn)明顯的二次拋物線關(guān)系。隨著每個(gè)因素的增加，響應(yīng)值回收率Y也在增大。根據(jù)吸附動(dòng)力學(xué)理論，隨著pH(B)、上樣濃度(A)、洗脫濃度(C)、洗脫速度(D)的增加，響應(yīng)值回收率Y出現(xiàn)極大值，后隨著 A、B、C、D再增加，萃取率 Y呈現(xiàn)不同斜率的下降，該回歸模型具有穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。借助Design-Expert Software 8.0中多元二次回歸模型對(duì)TFC萃取率進(jìn)行估算，對(duì)二次拋物線函數(shù)模型進(jìn)行極值分析，預(yù)測(cè)四因素的最佳組合為:上樣濃度0.86 mg/mL，pH=6，洗脫濃度74.27%和洗脫流速2.23 mL/min此時(shí)模型預(yù)測(cè)極大值Y=87.3667%(P=0.994)。在Z坐標(biāo)下進(jìn)行3組重復(fù)試驗(yàn)，TFC回收率平均高達(dá)到85.82%，表明該回歸模型能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)TFC大孔樹脂吸附性能。

圖7 兩因素交互影響回收率的響應(yīng)曲面圖分析Fig.7 Response surface analysis of the recovery rate affected by two-factor

3 結(jié)論

以茼蒿為原料，對(duì)比大孔樹脂分離純化總黃酮的性能，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)相結(jié)合的形式，篩選并優(yōu)化大孔樹脂的純化工藝條件。經(jīng)試驗(yàn)考察5種不同特性的大孔樹脂中，D-101大孔樹脂對(duì)TFC的吸附純化顯示出最佳的性能。D-101大孔樹脂分離純化TFC的泄漏點(diǎn):上樣體積60 mL，飽和點(diǎn):210 mL。洗脫曲線表明80 mL的95%乙醇溶液可以將黃酮完全洗脫下來。響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析顯示:上樣pH對(duì)TFC回收率影響差異達(dá)到顯著水平，而上樣濃度、洗脫濃度和洗脫速度3個(gè)因素對(duì)TFC回收率影響差異不顯著。通過回歸方程模擬預(yù)測(cè)最優(yōu)純化條件組合:上樣濃度0.86 mg/mL，pH=6，洗脫濃度74.27%和洗脫流速2.23 mL/min，TFC回收率從最初的最高值65.19%提升至87.366%。

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