溫度對“半胱氨酸-木糖”模型體系初始美拉德中間體及揮發性風味物質形成的影響*

曹長春，石景艷，謝建春，孫寶國

(食品質量與安全北京實驗室，北京市食品風味化學重點實驗室，北京工商大學，北京，100048)

美拉德反應又稱“羰-氨”反應，是食品熱加工風味形成的重要途徑之一。半胱氨酸是肉香味形成的重要前體，有關半胱氨酸與還原糖發生美拉德反應產生肉香味的研究已有較多報道［1-6］。Hofmann 等［5］分析鑒定了半胱氨酸分別與葡萄糖和鼠李糖反應產生的肉香味成分;Cerny等［6］將半胱氨酸與同位素標記的核糖反應，研究了肉香味成分的形成途徑。

與其他氨基酸不同，半胱氨酸因含有巰基官能團，在Maillard初級反應階段除形成半胱氨酸Amadori重排物外，還可形成2-糖基噻唑烷-4-羧酸中間體［7-8］。初級階段形成的該中間體往往占有很大比例，對美拉德反應有抑制作用。有報道［9-10］半胱氨酸的存在可抑制大豆蛋白酶解液、蘋果汁和葡萄汁等的非酶褐變。但2-糖基噻唑烷-4-羧酸與半胱氨酸Amadori重排物存在可逆轉化，在受熱條件下，半胱氨酸Amadori發生降解反應，從而導致可逆平衡被打破，使形成的2-糖基噻唑烷-4-羧酸中間體不斷轉化成半胱氨酸Amadori。半胱氨酸Amadori的受熱降解反應，涉及了經1，2-烯醇化或2，3-烯醇化及脫水、脫氨等過程形成糠醛、羥甲基糠醛、呋喃酮、二羰基化合物等降解產物。這些與還原糖相關的降解產物再與半胱氨酸降解產生的硫化氫或氨作用，可形成2-甲基-3-呋喃硫醇、2-糠硫醇、2-甲基噻吩、3-甲基吡嗪等含硫化合物或雜環化合物，從而使熱反應產物出現似肉的香味［6，11-13］。

溫度對美拉德反應有重要影響，不同溫度下美拉德反應初始中間體Amadori的形成速率和積累量不同，產物的揮發性風味和顏色不同［14-16］。在原料組成和pH值等其他條件固定時，溫度越高，Amadori的降解速率越快，促使2-糖基噻唑烷-4-羧酸中間體轉化成半胱氨酸Amadori的速率也越快，從而半胱氨酸消耗得越多，利用率越高。本文以“半胱氨酸-木糖”為模型，研究了不同溫度下，體系中形成的初始美拉德中間體2-木糖基噻唑烷-4-羧酸(2-xylulosylthiazolidine-4-carboxylic acid，XTCA)、半胱氨酸 Amadori的含量及半胱氨酸的含量隨反應時間的變化及溫度對揮發性風味物質形成的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

15 mL耐壓密封管，北京欣維爾玻璃儀器有限公司;手動固相微萃取手柄、75 μm Carboxen/PDMS萃取纖維、15 mL樣品瓶及聚丙烯瓶蓋、聚四氟乙烯-硅樹脂隔膜，美國Supelco公司。

PHSJ-5型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司;OSB-200油浴型旋轉蒸發儀，日本Eyela公司;DF-101型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南鞏義市予華儀器有限公司;Agilent1100高效液相色譜儀，美國Agilent公司;SEDEX75蒸發光散射檢測器(ELSD)，法國SEDERE公司;XWK-Ⅲ無油空氣泵，天津市華生分析儀器廠;7890A/5975C型氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司。

1.2 試劑與材料

L-半胱氨酸、D-(+)-木糖，生化試劑，國藥集團北京化學試劑有限公司;二水合磷酸二氫鈉、甲酸銨、甲酸，均為分析純，國藥集團北京化學試劑有限公司;NaOH，分析純，天津市光復科技發展有限公司;1，2-鄰二氯苯，分析純，北京化學試劑公司;C7～C30正構烷烴、色譜純乙腈，迪馬科技有限公司;AG 50W-X4 H-型陽離子交換樹脂(200～400目)，美國 Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型反應

在15 mL耐壓密封管中，加入 L-半胱氨酸1 mmol(0.121 g)、D-(+)-木糖 1 mmol(0.150 g)，NaH2PO4-NaOH緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=5.5)5 mL，油浴加熱。

(1)分別在溫度 120、130、140、150、160 ℃下，反應90 min，并每隔10 min取樣，按1.3.2進行固相萃取/高效液相色譜分析，研究溫度對美拉德反應初始中間體形成及半胱氨酸利用率的影響。平行做3份樣品。

(2)分別在溫度 120、130、140、150、160 ℃下，反應60 min，按1.3.3固相微萃取/氣-質聯機分析，比較不同溫度下產生的揮發性風味物質。平行做3份樣品。

1.3.2 固相萃取/高效液相色譜分析

固相萃取柱，填料為陽離子交換樹脂，800 mg/1.5 mL，實驗室手動填裝。先用6 mL 1 mol/L HCl活化，再將1.3.1(1)中所取反應液上樣1 mL，10 mL水洗，6～8 mL 0.5 mol/L氨水溶液洗脫，收集氨水洗脫液，旋轉蒸發濃縮至約1.5 mL，定容至2 mL，0.45 μm濾膜過濾，待高效液相色譜分析。

高效液相色譜分析條件:Waters Xbridge Amide(4.6 mm × 150 mm，3.5 μm)色譜柱;流動相:0.02 mol/L甲酸銨與乙腈(體積比=4∶6)的混合溶液，用0.02%甲酸調至pH 6;流速:0.5 mL/min;進樣1 μL，共運行11 min。柱溫25℃。蒸發光散射檢測器檢測，蒸發管溫度40℃，霧化氣(空氣)流速3.5 bar，增益值5。

1.3.3 固相微萃取/氣-質聯機分析

萃取纖維按照使用說明事先老化。將1.3.1(2)制備的反應液轉移到15 mL固相微萃取樣品瓶中，加入1.5 μL 內標鄰二氯苯(200 μg/mL，溶劑甲醇)、約1 g NaCl，混合均勻，水浴加熱至60℃平衡10 min后，60℃頂空吸附30 min。

氣相色譜-質譜分析:(1)色譜柱DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，溫度40 ℃，以4 ℃/min升至230℃;(2)色譜柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，溫度40℃，以3℃/min升至180℃，再以20℃/min升至280℃，保持2 min。載氣為He，流速1.0 mL/min，進樣口溫度250℃，不分流進樣，萃取纖維脫附5 min。電子轟擊離子源(EI)，能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃。

在相同條件下進樣C7～C30正構烷烴，計算保留指數。

所檢測化合物含量計算見公式(1):

式中:m為鑒定化合物質量，ng，A為化合物峰面積;ρ 為內標 1，2-二氯苯質量濃度，200 μg/mL;A0為內標面積，V為加入的內標 1，2-二氯苯體積，1.5 μL。

2 結果與討論

2.1 固相萃取/高效液相色譜分析

圖1為溫度為140℃時模型反應20 min取樣經固相萃取處理后，高效液相色譜-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)分析所得譜圖。

圖1 140℃時“半胱氨酸-木糖”反應20 min取樣的固相萃取/高效液相色譜分析譜圖Fig.1 The HPLC-ELSD chromatogram in the analysis of the reaction mixture of cysteine with xylose for 20 min at 140℃after pretreated by solid phase extraction

標號1的峰為半胱氨酸的峰;標號2的峰為XTCA的峰，標號3的峰為半胱氨酸-Amadori的峰，3種物質分離較好。ELSD是20世紀90年代出現的一種通用性質量型檢測器，能檢測揮發性低于流動相的樣品，其響應不依賴于被分析物質的理化性質，具有靈敏度高、受溫度等實驗條件影響小和線性范圍寬等優點［17］，因而本文采用ELSD檢測定量研究和比較反應體系中的XTCA、半胱氨酸-Amadori及半胱氨酸的含量受溫度的影響。

2.2 XTCA、半胱氨酸Amadori及半胱氨酸的含量隨時間變化

在不同溫度下進行模型反應實驗，按10 min間隔取樣，分析體系內初始中間體 XTCA、半胱氨酸Amadori及半胱氨酸的含量，分別繪制XTCA、半胱氨酸Amadori的含量(峰面積)、半胱氨酸的含量(占初始面積的百分比)隨反應時間變化曲線，見圖2。

圖2 不同溫度下XTCA(a)、半胱氨酸-Amadori(b)及半胱氨酸(c)的含量隨反應時間的變化曲線Fig.2 The change curves of the contents of XTCA，cysteine-Amadori，and cysteine，respectively，with times under different reaction temperatures

實驗中發現，弱酸性條件下美拉德反應初始中間體XTCA非常易于形成，室溫下即檢測到可觀量的XTCA。由圖2可知，從120～160℃，反應開始10min時，體系內已有大量XTCA，且XTCA含量遠高于半胱氨酸Amadori含量。隨著反應時間的進行，XTCA仍在生成，但因不斷轉化成半胱氨酸Amadori，因此在各溫度下其含量均呈下降趨勢，且溫度越高下降得越快。而半胱氨酸Amadori的積累量在各溫度下呈現的變化趨勢不同:120、130、140℃呈現鐘形曲線，分別在50、20、20 min達到極值，然后慢慢下降，其中130℃反應90 min時和140℃反應60 min時已很少，但120℃反應90 min時仍有較多剩余;150、160℃半胱氨酸Amadori的含量則一直呈陡峭的下降趨勢，分別在60，30 min時已很少。

相比之下，溫度越低半胱氨酸Amadori的降解速率越慢，體系內XTCA及半胱氨酸Amadori的積累量就越多，表現為相同時間下120℃時檢測到的XTCA及半胱氨酸Amadori的含量在各溫度中均最高，且含量的下降趨勢最平緩。由于半胱氨酸Amadori的含量是XTCA的轉化(使其增加)及半胱氨酸Amadori降解(使其減少)兩方面綜合作用后的結果，因而在較低溫度時(120，130，140℃)半胱氨酸 Amadori出現極值，在較高溫度時(150，160℃)因降解速率大于生成速率一直呈現下降趨勢。

此外，由圖2半胱氨酸的含量下降趨勢曲線還可以看出，溫度越高，反應越快，半胱氨酸消耗越快。在160℃下反應40 min半胱氨酸幾乎消耗完，140℃下反應60 min剩余20.3%，而在溫度120℃反應90 min時半胱氨酸仍有較多剩余，為46.2%。

2.3 不同溫度下所得反應產物的顏色、氣味及揮發性成分比較

相同時間下，反應溫度不同，體系內XTCA、Amadori的積累量及半胱氨酸的消耗量不同，產生的揮發性化合物種類及含量不同。在 120、130、140、150、160℃下分別反應60 min，所得反應產物的顏色、氣味及檢測到的揮發性化合物的峰個數和含量結果見表1。

由表1可知，溫度越高，反應液的顏色越深，褐變程度越高。120℃時為蔥、蒜香，高于120℃則出現焦糊味，160℃時出現刺激性氣味。比較不同溫度下所得反應產物的揮發性成分峰個數和總量，溫度高(140，150，160℃)時產生的揮發性化合物峰個數多且總量高，140℃時均為最大。對肉香味貢獻較大的為含硫化合物，溫度較低時(120，130℃)產生的含硫揮發性成分的峰個數和含量較少，溫度高(140，150，160℃)時二者均顯著增多，160℃時峰個數最多，但140℃時含硫化合物的含量最多。這可能因為溫度較低時(120，130℃)反應速率慢，半胱氨酸Amadori降解慢，產生的揮發性成分的峰個數和含量均較少;而溫度較高時(150，160℃)半胱氨酸Amadori降解快，反應復雜，一些含硫化合物的縮合、聚合反應較為強烈，例如2-甲基-3-呋喃硫醇轉化成其二聚體雙(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚，從而造成檢測到的峰個數增加，但有些化合物聚合后揮發度降低會使檢測到的總含量減少。綜合考慮半胱氨酸利用率、香味特征、及含硫風味物質的峰個數和含量等因素，認為140℃反應60 min為采用“半胱氨酸-木糖”模型反應研究肉香風味物質形成的較適宜條件。

表1 不同溫度條件下所得反應產物的顏色、氣味及檢測的揮發性化合物的量Table 1 The colors，smells and the amount of volatile compounds analyzed from the reaction products prepared in different reaction temperatures by solid phase micro-extraction(SPME)and GC-MS

2.4 140℃下反應產物檢測的揮發性風味物質

“半胱氨酸-還原糖”美拉德反應是產生肉香味的重要反應。對肉香味有貢獻的主要是含硫化合物及含O或N雜環化合物。為了確保鑒定結果的準確性，實驗中采用極性、弱極性雙柱定性，通過NIST11標準質譜庫檢索及核對保留指數對檢測到的含硫化合物和雜環化合物進行鑒定。

由表2可知，從140℃條件下的熱反應產物中共鑒定出53種成分，包括含硫類(40種)，含氮雜環類(5種)，含氧雜環類(8種)。無論是弱極性柱還是極性柱，含量最高的均為含硫化合物，其次為含氧雜環，含氮雜環相對較少。含硫化合物包括硫醇及硫醚類(18種)，噻吩類(18種)，噻唑類(4種);含量最高的為硫醇及硫醚類，噻吩類其次，噻唑類含量最少。硫醇、噻吩、噻唑均為“半胱氨酸-還原糖”反應常出現的揮發性香味成分，硫醇進一步發生縮合或聚合反應可形成硫醚。硫醇類一般具有大蒜味、烤香味、H2S樣味等;噻吩類具有洋蔥味、焦味、咖啡香味、橡皮味等;噻唑類具有烤肉味、堅果味。

2-甲基-3-呋喃硫醇，2-糠硫醇、2-噻吩硫醇、2-甲基噻吩并［2，3-b］噻吩、2，5-噻吩二甲醛、二糠基二硫醚、雙(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚、糠醛等為檢測到的主要成分。2-甲基-3-呋喃硫醇氣味閾值為0.002 5 ng/L，具有蔥香、蒜香和硫化物氣味;2-糠硫醇氣味閾值為0.005 ng/L，具有烤香、咖啡香、肉香，它們都是構成煮牛肉、豬肉的主要香味成分［18］;雙(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚和二糠基二硫醚分別為2-甲基-3-呋喃硫醇、2-糠硫醇的二聚體，也是煮肉湯味的重要化合物［19］。

表2 140℃反應60 min產物中檢測出的主要揮發性風味物質Table 2 The main volatile flavor compounds identified by SPME/GC-MS from the reaction products prepared at 140℃for 60 min

續表2

續表2

3 結論

(1)在 pH 5.5 及溫度120，130，140，150，160 ℃的條件下，“半胱氨酸-木糖”反應形成的美拉德初始中間體2-木糖基噻唑烷-4-羧酸與半胱氨酸Amadori的含量存在正相關，溫度越高，半胱氨酸Amadori隨反應時間的降解越快，二者在體系內的積累量越低，造成半胱氨酸的利用率越高，反應產物的氣味越濃，但同時夾雜的焦糊氣味也越重。

(2)綜合考慮半胱氨酸的利用率、反應產物的肉香特征、及產生的揮發性化合物總量及含硫化合物的量，得出140℃反應60 min為較適宜條件。采用雙柱定性、保留指數比對、標準質譜庫檢索，從140℃反應60 min的產物中鑒定出53種化合物，包括2-甲基-3-呋喃硫醇、2-糠硫醇等在內的重要含硫肉香物質40種，含氮雜環5種，含氧雜環8種。

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