藍圓鲹在腌制過程中N-二甲基亞硝胺和N-二乙基亞硝胺的變化規律*

陳勝軍，楊賢慶，李來好，2，吳燕燕，樊麗琴，戚勃，鄧建朝，胡曉

1(中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，國家水產品加工技術研發中心，廣東廣州，510300)

2(南海生物資源開發與利用協同創新中心，廣東廣州，510300)

咸魚是一種傳統的水產品加工與保藏食品，在腌制過程中，營養成分發生代謝與反應，形成許多風味成分，深受世界各國消費者的喜愛［1-3］。但是，隨著人們對水產品質量安全要求的提高，咸魚的安全性問題成為人們關注的焦點，尤其是咸魚在加工過程中產生的亞硝酸鹽和胺類物質結合形成N—亞硝基化合物。研究表明，腌制食品中 N-亞硝基化合物是含有結構的化合物，由一個亞硝基(—NO)與一個仲胺基(R1R2＞N—)的氮原子相互鍵合而成的化合物，根據其化學結構可分為N-亞硝胺、N-亞硝酰胺兩大類。N-亞硝基化合物是一類致癌性很強的化學物質，大量的動物致癌性實驗表明，揮發性N-亞硝胺可能對人類有致癌作用，國際癌癥研究機構(the international agency for research on cancer，IARC)認為，N-二甲基亞硝胺(NDMA)和 N-二乙基亞硝胺(NDEA)是最可能導致人類致癌的物質［4-6］。我國國家標準 GB 2762中規定了食品中N-亞硝胺的限量標準:其中N-二甲基亞硝胺不超過4 μg/kg［7］，N-二乙基亞硝胺不超過 7 μg/kg［8］。從腌制海產魚蝦食品中可檢測到不同水平的揮發性N-亞硝胺等致癌物，其中以NDMA最為常見［9］，Fong和Huang等分別報道了廣州和香港市售海產腌制食品中含NDMA和N-亞硝胺吡咯烷(NPYR)［10-11］情況。這對咸魚加工業造成很大的影響，咸魚產品的食用安全性受到嚴重挑戰。研究表明，咸魚等腌制食品與人群中的鼻咽癌、胃癌等有一定的相關性［12］，但對咸魚中N-亞硝基化合物的形成過程、形成機理至今尚未完全明確。對于咸魚中N-亞硝基化合物的報道較少，咸魚在加工過程中發生許多的理化反應，產生大量的物質，使其形成了一個非常復雜的體系。本研究以藍圓鲹(Decapterus maruadsi)為原料，研究在腌制過程中，在不同種類的鹽、溫度、鹽度等腌制條件下，探討腌制過程中N-亞硝胺的變化規律，進一步確定腌制咸魚的條件，從而降低咸魚中N-亞硝胺等有害物質的含量，使咸魚的食用安全得到保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰鮮藍圓鲹，每尾重(150±30)g，購于廣州市鷺江市場;食用鹽(精鹽)，購于廣州華潤萬家超市;粗鹽(海水曬制)，購于廣州市一德路海鮮批發市場。

試劑:NDMA和NDEA標準品(純度99.0%，購自德國Dr1Ehrenstorfer公司);二氯甲烷(優級純)。

1.2 主要儀器設備

氣相色譜質譜聯用儀(GC/MS-QP2010)，島津;旋轉蒸發儀(N-1000)，日本EYELA;多管架自動平衡離心機(TDZ5-WS)，中國湘儀。

1.3 樣品制備及取樣［13］

1.3.1 濕腌法

溫度控制在25℃條件下，采用飽和鹽水進行濕腌，用精鹽和粗鹽2種食鹽腌制，腌制過程中分別在0、12、24、36、48、60、72、96 h 取樣，去頭、骨，取肌肉等可食部分絞碎混合均勻后測定樣品中 NDMA和NDEA含量。

1.3.2 干腌法

將魚與食鹽一起分層放于容器中的腌制方法。在魚體表擦鹽后，將它們層裝在腌制容器內，各層之間均勻地撒上食鹽，依靠外滲汁液形成鹽液(鹵水)，腌制劑在鹵水內通過擴散作用向魚體內部滲透，比較均勻地分布于魚體內進行腌制。表面搓鹽(鹽和魚質量比分別為1∶3、1∶5和1∶8)，腌制溫度選取4 ℃和25 ℃進行試驗。分別在腌制的第 0、2、4、6、8、10、12、14、16天取樣 ，去頭、骨，取肌肉等可食部分絞碎混合均勻后測定樣品中NDMA和NDEA含量。

1.4 檢測方法

準確稱取混勻樣品20.00g采用氣相色譜-質譜儀法(GC-MS)測定NDMA和NDEA的含量［14-15］。

1.5 數據分析

實驗結果為3次平行實驗數據的平均值，采用EXCEL對數據進行整理，用統計分析軟件SPSS 12.0進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同種類食鹽對NDMA和NDEA含量的影響

用不同種類的食鹽腌制藍圓鲹，腌制過程中NDMA和NDEA含量變化趨勢如圖1、圖2所示。

圖1 食鹽種類對NDMA含量的影響Fig.1 Effect of salt type on the content NDMA

圖2 食鹽種類對NDEA含量的影響Fig.2 Effect of salt type on the content of NDEA

由圖1和圖2可看出，在腌制過程中，腌制初期2種食鹽腌制的樣品中NDMA和NDEA的含量差別不大，隨著腌制過程的不斷進行，粗鹽腌制的樣品中NDMA和NDEA的含量始終高于精鹽腌制的樣品中的NDMA和NDEA的含量。前期相關研究與文獻表明，胺類物質作為前體物質很容易與亞硝酸鹽結合形成亞硝胺類化合物［16-18］。從圖1可以看出，粗鹽腌制36 h時NDMA含量達到最大值4.63 μg/kg，與腌制前(2.31 μg/kg)差異顯著(P ＜0.05)，之后，NDMA含量呈下降趨勢;用精鹽腌制60 h時NDMA含量達到最大值4.04 μg/kg，與腌制前(2.31 μg/kg)差異顯著(P＜0.05)。從圖2可以看出，粗鹽腌制72 h時NDEA含量達到最大值3.12 μg/kg，與腌制前(0.57 μg/kg)差異顯著(P＜0.05)，之后，NDEA含量呈下降趨勢;用精鹽腌制72 h時NDEA含量達到最大值2.76 μg/kg，與腌制前(0.57 μg/kg)差異顯著(P ＜0.05)。結果表明，不同種類的食鹽腌制的樣品中NDMA和NDEA的含量存在差異，粗鹽腌制的樣品中NDMA和NDEA的含量更高。因粗鹽中含有的雜質、微生物等更容易使樣品在腌制過程中形成N-亞硝胺的前體物質，從而使 N-亞硝胺的含量增大［17］。因此，考慮到鹽來源的可控制性及產品質量的穩定性，故后續研究采用精鹽進行腌制。

2.2 溫度對NDMA和NDEA含量的影響

采用干腌法進行腌制，確定鹽和魚質量比鹽度為1∶3，分別選擇4℃和25℃考察溫度對 NDMA和NDEA 含量的影響。分別在腌制的第0、2、4、6、8、10、12、14、16天取樣測定樣品中 NDMA和NDEA的含量。腌制過程樣品中NDMA和NDEA的含量在不同溫度下的變化如圖3、圖4所示。

圖3 溫度對NDMA含量的影響Fig.3 Effect of temperature on the content of NDMA

圖4 溫度對NDEA含量的影響Fig.4 Effect of temperature on the content of NDEA

從圖3、圖4可知，隨著腌制時間的延長，不同溫度條件下NDMA、NDEA含量的變化趨勢基本一致，在腌制初期含量有所升高，之后降低，然后達到峰值，隨著腌制過程的不斷進行，NDMA、NDEA的含量下降且變化趨勢逐漸平緩。其原因在于腌制初期前體物質亞硝酸鹽、胺類物質均增長速率較快，含量較高，在適宜的條件下反應生成NDMA和NDEA的機率較大，故NDMA和NDEA的含量升高;之后，NDMA和NDEA的含量隨著前體物質含量的變化而變化。4℃和25℃條件下腌制時，NDMA和NDEA均在第8天達到峰值，其中NDMA峰值分別為3.06 μg/kg和3.71 μg/kg，NDEA 的峰值分別 1.42 μg/kg 和 2.22 μg/kg。表明在相同鹽度腌制條件下，溫度越高，NDMA、NDEA的含量越高。高溫利于微生物的活動，使NDMA、NDEA的前體物質大量生成，且高溫更利于反應的進行，并且在一定條件下，溫度越高，乳酸發酵越快，酸性環境更利于N-亞硝胺的形成［20］。

2.3 鹽度對NDMA和NDEA含量的影響

采用干腌法腌制，控制溫度為25℃，鹽和魚質量比分別為 1∶3、1∶5、1∶8，分別在腌制的第 0、2、4、6、8、10、12、14、16天取樣測定樣品中 NDMA 和 NDEA 的含量。腌制過程樣品NDMA和NDEA的含量在不同鹽度下的變化如圖5、圖6所示。

由圖5、圖6可以看出，在相同溫度條件下，鹽度對NDMA和NDEA含量的影響較大，均表現出鹽和魚質量比為1∶5時，NDMA和NDEA的含量最高，鹽和魚質量比為1∶8時NDMA、NDEA的含量次之，鹽和魚質量比為1∶3時NDMA、NDEA的含量最低。其原因在于，在腌制咸魚的過程中，N-亞硝胺主要通過亞硝化途徑來合成。鹽和魚質量比為1∶3時，大部分微生物受到抑制作用。此時，它們的合成是由化學合成完成的，隨著前體物質(如:亞硝酸鹽、二甲胺、硝酸鹽等)含量的變化而呈現不穩定的波動趨勢。鹽和魚質量比為1∶5時，在部分嗜鹽菌的作用下，NDMA和NDEA的合成是由化學合成和生物合成共同完成，所以由化學合成作用使其含量達到峰值后，在微生物的作用下緩慢變化。鹽和魚質量比為1∶8時，此時生物合成占主導地位，使得整個過程變化平緩。另外，在腌制咸魚的過程中，存在的部分嗜鹽菌適合在鹽和魚質量比為1∶5的條件下生存，使得大量的前體物質存在，導致NDMA、NDEA的含量較高。另外2個鹽度，不適合微生物的生長，導致NDMA、NDEA的生物合成過程變的較為緩慢，所以含量相對較低［21-23］。

圖5 鹽度對NDMA含量的影響Fig.5 Effect of salinity on the content of NDMA

圖6 不同鹽度下NDEA含量的影響Fig.6 Effect of salinity on the content of NDEA

由圖5、圖6還可以看出，隨著腌制時間的延長，各組樣品中的NDEA的含量低于NDMA的含量。隨著腌制過程的進行，NDMA的峰值均出現在腌制的第8天，之后下降，慢慢趨于平緩;而NDEA的峰值有所變化，鹽和魚質量比為1∶3時，峰值出現在第8天，鹽和魚質量比為1∶5和1∶8的條件下峰值出現在第10天，比高濃度腌制條件滯后，表明高濃度的鹽腌制加速了NDEA峰的出現。在腌制的整個過程中，各個時間點測定的NDMA和NDEA的值均高于腌制前測定的值，與馬儷珍等研究的香腸中亞硝胺含量變化的結果一致［24］。隨著腌制時間的延長，前體物質胺類和亞硝酸鹽的含量不斷增加，在適宜的條件下，兩者反應會生成N-亞硝胺，隨著腌制的進行，魚體內的鹽度逐漸增加，對微生物有一定的抑制作用;此外，水分活度、pH值等的變化也會影響到NDMA和NDEA的合成［25］。N-亞硝胺的具體合成過程是一個復雜的過程，受多種因素的影響，有待于進一步研究。目前，在蔬菜、魚等腌制食品中發現的NDMA被認為主要是通過亞硝化作用反應機制產生［26］。

通過不同鹽度對它們含量的影響分析顯示，鹽和魚質量比為1∶5時其含量最高，因此，為避免NDMA、NDEA的大量產生，應該選擇在高鹽的條件下腌制。同時，高溫有利于反應的進行，所以高溫下NDMA、NDEA的生成量高于低溫條件下的生成量。為減少NDMA、NDEA的生成量，建議腌制時選擇低溫高鹽的條件下腌制。

2.4 濕腌法和干腌法對NDMA和NDEA含量的影響

采用濕腌和干腌法進行腌制，綜合圖1～圖4(濕腌選取精鹽進行腌制，干腌選取精鹽，鹽和魚質量比為1∶3，溫度均控制在25℃條件下進行腌制)分析魚肉在腌制過程中NDMA和NDEA的變化趨勢。濕腌法腌制時，樣品中NDMA和NDEA的峰值含量分別為4.04 μg/kg 和2.76 μg/kg，并在腌制 72 h 時達到最大峰值;干腌法時，樣品中NDMA和NDEA的峰值含量分別為3.71 μg/kg和2.11 μg/kg，并在腌制第8天時達到最大峰值。研究顯示，不同腌制方法對NDMA和NDEA含量的影響很大，腌制結束時，濕腌法中NDMA和 NDEA的含量分別為 3.95 μg/kg和1.91 μg/kg，干腌法中NDMA和NDEA的含量分別為2.71 μg/kg 和1.14 μg/kg，濕腌法中 NDMA 和NDEA的含量顯著高于干腌法中的含量(P＜0.05)。其原因在于濕腌法更利用亞硝基化反應的進行，促進了NDMA和NDEA的形成和產生。

3 結論

通過對藍圓鲹在不同腌制條件下樣品中NDMA和NDEA含量的變化規律進行研究，表明二者在腌制過程中會隨著不同溫度、不同鹽度的變化而變化，即溫度、鹽度、時間是影響其形成的因素。采用濕腌法時，對于不同種類食鹽腌制組，粗鹽腌制組的樣品中NDMA和NDEA含量較精制食鹽腌制組高;采用干腌法時，在相同鹽度下，腌制溫度越高，樣品中NDMA和NDEA的含量越高;在相同溫度下，鹽和魚質量比為1∶5時，NDMA和NDEA的含量最高，鹽和魚質量比為1∶8時，NDMA和NDEA的含量次之，鹽和魚質量比為1∶3時NDMA和NDEA的含量最低;干腌法超過10 d后，NDMA和NDEA含量峰值開始消失，含量平緩下降;采用濕腌法比干腌法樣品中NDMA和NDEA含量高。因此，為減少腌制產品中NDMA和NDEA的積累，建議采用精鹽低溫高鹽干腌法進行腌制，并在腌制時間超過10 d NDMA和NDEA含量的峰值開始降低后進行食用。

［1］ 章銀良，夏文水.腌魚產品加工技術與理論研究進展［J］.中國農學通報，2007，23(3):116-120.

［2］ Kose S，Hall G M.Fish Processing:Sustainability and New Opportunities［M］.Wiley-Blackwell Press，2010:138-166.

［3］ 任中陽，吳燕燕，李來好，等.腌干魚制品熱泵干燥工藝參數優化［J］.南方水產科學，2015，11(1):81-88.

［4］ 陳丙卿.營養與食品衛生學［M］.北京:人民衛生出版社，2000:216-221.

［5］ International Agency for Research onCancer(IARC).Some N-nitroso compounds:IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risk of chemicals to humans［M］.World Health Organization，1978.

［6］ ZOU Xiao-nong，LU Shih-hsin，LIU Bin.Volatile N-nitrosamines and their precursors in chinese salted fish-a possible etological factor for NPC in China［J］.International Journal of Cancer，1994，59(2):155-158.

［7］ GB 2762-2012.食品中污染物限量［S］.

［8］ GB 2762-2005食品中污染物限量［S］.

［9］ 魯夫雄，李銘新.廣東海產魚蝦食品的揮發性亞硝胺測定［J］.中國醫學科學院學報，1986，8(4):317-319.

［10］ FONG Y Y，CHAN W C.Dimethylnitrosamine in Chinese marine salt fish［J］.Food Chemistry Toxicology，1973，11:841-843.

［11］ Huang D P，Ho J H，Gough T.Analysis for volatile nitrosamines in salt-preserved foodstuffs traditionally consumed by southern Chinese［J］.IARC Science Publisher，1978，20:309-314.

［12］ 林昆，沈忠英，蔡樹深，等.我國南方食管癌高發區膳食亞硝胺水平及其相關因素研究［J］.衛生研究，1997，26(4):266-269.

［13］ 汪濤，楊風光，于謙林.無公害水產品加工綜合技術［M］.北京:中國農業出版社，2003:123-141.

［14］ GB/T 5009.26-2003.食品中N-亞硝胺類的測定方法［S］.

［15］ 吳燕燕，劉法佳，李來好，等.GC-MS檢測咸魚中N-亞硝胺的條件優化［J］.南方水產科學，2012，8(4):16-22.

［16］ 楊賢慶，樊麗琴，陳勝軍，等.咸魚干腌過程中亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量變化及其相關性分析［J］.食品與發酵工業，2009，35(10):55-58.

［17］ 陳勝軍，楊賢慶，樊麗琴，等.藍圓鲹在不同腌制條件下三甲胺和二甲胺含量變化規律［J］.食品科學，2012，33(13):58-61.

［18］ 馬儷珍，楊華，閻旭，等.鹽水火腿加工中影響亞硝基化合物生成因素的研究［J］.食品科學，2007，28(1):82-84.

［19］ ZENG Xue-feng，XIA Wen-shui，JIANG Qi-xing，et al.Chemical and microbial low-salt fermented whole fish product Suan yu［J］.Food Control，2013，30(2):590-595.

［20］ Herrmann S S，Duedahl O L，Granby K.Occurrence of volatile and non-volatile N-nitrosamines in processed meat products and the role of heat treatment［J］.Food Control，2015，48:163-169.

［21］ Sen N P，Seaman S W，Burgess C，et al.Investigation on the possible formation of N-nitroso-N-methylurea by nitrosation of creatinine in model systems and in cured meats at gastric pH［J］.Joural of Agriculture and Food Chemistry，2000，48(10):5 088-5 096.

［22］ Fong Y Y，Chan W C.Bacterial production of di-methyl Nitrosamine in salted fish［J］.Nature，1973，243，421-422.

［23］ Tozawa H，Kawabata T.Volatile N-nitrosamines in fish meal，with special reference to the mechanism of formation of N-nitrosothiazolidine［J］.IARC Scientific Publications，1991，105:214-218.

［24］ 馬儷珍，郭培，黃宗海.羊肉發酵香腸生產過程中亞硝胺含量的變化［J］.食品與發酵工業，2006，32(10):32-36.

［25］ Choi Y J，LIN T M，Tomlinson K，et al.Effect of salt concentration and temperature of storage water on the physicochemical properties of fish proteins［J］.LWTFood Science and Technology，2008，41(3):460-468.

［26］ Mirvish S S.Formation of N-nitroso compounds:chemistry，kinetics and in vivo occurrence［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，1975，31(3):325-351.