宮頸鱗癌EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達與其臨床特征及近期療效的相關性研究

通信作者：王若崢，女，博士，教授，主任醫師，博士生導師，研究方向：腫瘤放射治療應用基礎和臨床應用，E-mail：wrz8526@163.com。

宮頸鱗癌EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達與其臨床特征及近期療效的相關性研究

耿曉濤1， 馬棟輝1， 古麗娜·庫爾班1， 王若崢1,2

(新疆醫科大學1附屬腫瘤醫院放療中心,2新疆腫瘤學重點實驗室， 烏魯木齊830011)

摘要：目的探討宮頸鱗癌(cervical squamous cell carcinomas,CSCC)組織中表皮生長因子受體(EGFR)、Rab5a、Rab21蛋白表達及其與臨床特征及近期療效的關系，評估EGFR、Rab5a、Rab21蛋白在CSCC進展、轉移及近期療效中的價值。方法收集60例CSCC組織標本，采用免疫組織化學法檢測EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達情況。采用卡方或確切概率法、非參數Spearman等級相關、多因素Logistic回歸分析法分析其與臨床特征及近期療效的相關性。結果EGFR、Rab5a、Rab21蛋白陽性表達率分別為70.0%、73.3%、55.0%，EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達均與腫瘤分化程度、淋巴結轉移有關(P<0.05)，EGFR蛋白表達與臨床分期有關(P=0.005)，Rab21蛋白表達與腫瘤直徑有關(P=0.044)；Spearman等級相關分析顯示：EGFR與Rab5a蛋白表達水平呈正相關(r=0.428，P=0.001)，EGFR與Rab21蛋白表達水平呈負相關(r=-0.300，P=0.020)；EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達均不是影響近期療效的獨立因素(P>0.05)，EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達對客觀有效率RR無明顯影響(P>0.05)。結論EGFR蛋白表達可能為CSCC高危進展的參考指標；Rab5a在EGFR介導的信號傳導通路中可能發揮正性調節作用；Rab21在EGFR介導的信號傳導通路中可能發揮負性調節作用。

關鍵詞：宮頸腫瘤； 鱗狀細胞； 表皮生長因子； Rab5a； Rab21

基金項目：科技部國際合作項目(2012DFA31560)

作者簡介：耿曉濤(1989-)，男，在讀碩士，研究方向：腫瘤放射治療臨床應用研究。

中圖分類號：R737.33

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.025

[收稿日期：2014-10-21]

The association studies of EGFR, Rab5a, Rab21 expression with clinical

characteristics and short-term efficacy in cervical squamous cell carcinoma

GENG Xiaotao1， MA Donghui1， Gulina Kuerban1， WANG Ruozheng1,2

(1DepartmentofRadiationOncology,TheAffiliatedTumorHospital,2KeyLaboratoryofOncology,

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between EGFR, Rab5a, Rab21 protein expression and clinical features and the short-term efficacy in cervical squamous cell carcinoma. MethodsImmunohistochemistry method was used to detect EGFR, Rab5a, Rab21 protein expression levels in 60 cases of CSCC. Chi-Square, Spearman rank correlation, Logistic regression analysis method were used. ResultsThe protein expression rates of EGFR, Rab5a, Rab21 were 70.0%, 73.3%, 55.0%, EGFR, Rab5a, Rab21 protein expression were correlated with lymph node metastasis and tumor differentiation (P<0.05); EGFR protein expression was correlated with clinical stage (P=0.005); Rab21 protein expression was correlated with the diameter of tumor (P=0.044); Spearman rank correlation analysis showed that EGFR was positively correlated with Rab5a (r=0.428, P=0.001) and EGFR was negatively correlated with Rab21 expression (r=-0.300, P=0.020). EGFR, Rab5a and Rab21 protein expression were not the independent factors of the short-term efficacy in CSCC (P>0.05); EGFR, Rab5a and Rab21 protein expression had no significant effect on objective efficiency (P>0.05). ConclusionEGFR protein expression may be the reference index of progression of CSCC; Rab5a may play a positive role in the regulation of EGFR-mediated signal transduction pathway while Rab21 may play a negative role.

Key words: cervical neoplasms; Neoplasms，squamous cell；Receptor; epidermal growth factor; Rab5a; Rab21; short-term efficacy

據WHO報道，中國宮頸癌發病率居世界第二位，死亡率居首位，且呈現年輕化趨勢，嚴重威脅女性健康。在宮頸癌中，鱗癌是主要的病理類型，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor， EGFR)及其信號通路參與了宮頸癌的發生及進展，參與EGFR信號通路的多種蛋白已經被證實與宮頸癌的發生和預后相關[1]。Rab蛋白家族是EGFR信號通路的重要組成部分，其成員Rab5a和Rab21蛋白在參與腫瘤細胞浸潤及轉移的同時能影響EGFR介導的MAPK信號通路。目前，宮頸鱗癌(CSCC)中Rab5a和Rab21蛋白表達對EGFR及其介導的信號傳導通路關系仍不清楚。本實驗通過探討CSCC中EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達與其臨床特征及近期療效的關系，分析Rab5a、Rab21蛋白在EGFR介導的MAPK信號通路中的作用，評估EGFR、Rab5a、Rab21蛋白對CSCC進展、轉移及近期療效的價值。

1資料與方法

1.1一般資料選取2012年9月-2013年9月新疆醫科大學附屬腫瘤醫院60例CSCC患者的組織標本，無近期妊娠史及腫瘤病史，年齡30～70歲，KPS≥60分。按照國際婦產科協會(FIGO)2009年宮頸癌分期：Ⅱ期27例，Ⅲ期31例，Ⅳ期2例；腫瘤分化程度：高分化3例，中分化34例，低分化23例。根據國內外年齡分組標準[4]：年輕宮頸癌(≤35歲)組與中老年宮頸癌組(>35歲)。根據國內外參考標準[5-6]，腫瘤直徑大小以4 cm為界分兩組。全組患者均有完整的臨床及病理學資料。

1.2治療方法依據國家衛生部婦科腫瘤診治規范，中晚期宮頸癌治療行放療為主結合鉑類為主化療的綜合治療。放療方案：(1)體外盆腔大野放療：放射野恥骨聯合下緣以下4 cm為下緣，腰5椎體上緣為上界，股骨頭中線向外旁開1.0 cm為兩側緣，前后野對應。放療劑量前后野輪流能量6MV-X線照射，源皮距SSD為100 cm，總劑量為3 000 cGy。(2)體外盆腔四野放療：放射野及劑量：在盆腔大野的基礎上中心4 cm擋鉛，保護直腸及膀胱，總劑量為2 500 cGy。(3)三維高劑量率腔內后裝治療：擬行6～7次，A點共計3 600～4 200 cGy。照射范圍：宮頸、子宮、陰道上段、宮旁三角。化療方案(體外盆腔大野放療2 000 cGy左右開始化療，共行3～6個療程)：PVB(順鉑50 mg/m2+鹽酸博萊霉素30 mg+硫酸長春新堿1.5 mg/m2)或TP(紫杉醇135 mg/m2+順鉑50 mg/m2)。

1.3療效評價標準患者治療結束后3個月，行婦檢、影像學(B超或骨盆MRI/CT)及腫瘤相關抗原等檢查。根據美國ASCO會議上提出的實體瘤療效評價標(RECIST)：完全緩解(CR)：可見腫瘤病灶完全消失，無新病灶出現，至少維持4 w；部分緩解(PR)：腫瘤病灶最大徑之和減小30%以上，至少維持4 w；疾病穩定(SD)：腫瘤病灶最大徑之和縮小不足30%或增大未超過20%，無新病灶出現；病變進展(PD)：腫瘤病灶最大徑之和至少增加≥20%或有新病灶出現。客觀有效率RR(緩解率)=(CR+PR)/(CR+PR+SD+PD)。

1.4主要試劑及檢測方法一抗(鼠抗人EGFR單克隆抗體、兔抗人Rab5a多克隆抗體、鼠抗人Rab21多克隆抗體)購自美國Santa Cruz公司；二抗(PV-6000試劑盒)購自北京中杉金橋科技有限公司。每個蠟塊連續4 μm厚切片5張，分別用于HE、免疫組化染色及預實驗，用己知陽性切片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。

1.5結果判定標準以胞漿和(或)胞膜出現棕黃色顆粒者為陽性細胞。陰性(-)：陽性細胞數≤10%，陽性：陽性細胞數>10%，其中11%～25%為(+)，26%～50%為(++)，51%～75%為(+++)，76%～100%為(++++)。

1.6統計學處理采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計數資料用百分比表示，組間差異由卡方或四格表確切概率法檢驗，兩者相關性由非參數Spearman等級相關法檢驗，近期療效的多因素分析應用Logistic回歸分析法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1CSCC組織中EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達EGFR蛋白陽性定位于胞漿及胞膜(圖1)，Rab5a蛋白陽性定位于胞漿及胞膜(圖2)，Rab21蛋白陽性定位于胞漿及胞膜(圖3)。60例患者中，EGFR蛋白陽性表達率為70.0%(42/60)，Rab5a蛋白陽性表達率為73.3%(44/60)，Rab21蛋白陽性表達率為55.0%(33/60)，見表1。

表1　CSCC組織中EGFR、Rab5a和Rab21蛋白表達率/例(%)

2.2CSCC組織中EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達關系EGFR蛋白陽性表達組中，Rab5a、Rab21蛋白陽性表達率分別為85.7%、45.2%，EGFR蛋白陰性表達組中分別為44.4%、77.8%，差異均有統計學意義(P=0.001、0.020)(表2)。Spearman相關分析顯示:CSCC組織中EGFR與Rab5a蛋白表達呈正相關(r=0.428，P=0.001)，EGFR與Rab21蛋白表達呈負相關(r=-0.300，P=0.020)(表2)。

表2　CSCC組織中EGFR蛋白表達與Rab5a、Rab21蛋白

2.3CSCC組織中EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達與臨床特征的關系EGFR蛋白表達與臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移有關(P=0.005、0.006、0.000)，與年齡、民族、HPV感染、腫瘤直徑無關(P>0.05)；Rab5a蛋白表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移有關(P=0.002、0.000)，與年齡、民族、HPV感染、臨床分期、腫瘤直徑無關(P>0.05)；Rab21蛋白表達與腫瘤分化程度、腫瘤直徑、淋巴結轉移有關(P=0.001、0.044、0.027)，與年齡、民族、HPV感染、臨床分期無關(P>0.05)(表3)。

表3　EGFR、Rab5a、Rab21表達與CSCC患者臨床特征的關系/例(%)

2.4CSCC組織中EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達及臨床特征對客觀有效率的關系分析60例患者中6例失訪，隨訪率為90%。患者CR47例，PR2例，SD3例、PD2例，客觀有效率為90.7%，維吾爾族和漢族患者RR分別為91.7%(33/36)、88.9%(16/18)，差異無統計學意義(P>0.05)；腫瘤直徑<4 cm組客觀有效率RR為100%(30/30)，≥4 cm組為79.2%(19/24)，差異有統計學意義(χ2=4.631，P=0.031)；EGFR陽性、陰性組RR分別為91.9%、88.2%，Rab5a陽性、陰性組分別為92.1%、87.5%，Rab21陽性、陰性組為93.3%、87.5%，差異均無統計學意義(P>0.05)；低分化組客觀有效率(100%)較中-高分化組(83.9%)明顯增高，但差異無統計學意義(P=0.122)，Spearman相關分析顯示：客觀有效率RR與腫瘤分化程度呈正相關(r=0.275，P=0.044)，RR與年齡、HPV感染、臨床分期、淋巴結轉移、治療方法無相關性(P>0.05)(表4)。

2.5近期療效分析將EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達、腫瘤直徑及腫瘤分化程度納入logistic多因素回歸分析。結果顯示：在CSCC中，腫瘤直徑、腫瘤分化程度及EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表達均不是影響近期療效的獨立因素(表5)。

3討論

表皮生長因子受體(EGFR)是繼高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)之后，與宮頸癌的發生發展密切相關的重要因素之一[11]，也是目前惡性腫瘤靶向藥物治療研究最多的靶點之一，因此研究其介導的信號傳導通路中的正、負調控機制意義重大。目前研究EGFR信號傳導通路中最廣泛的通路之一為ras/raf/MEK/MAPK信號傳導通路，配體與EGFR受體結合后激活受體，通過內吞上調、下調該信號傳導通路。Rab家族是Ras超家族中的一個最大亞家族,其蛋白為小GTP結合蛋白。Rab蛋白與腫瘤的發生發展密切相關，且部分Rab蛋白可以通過EGFR的內吞來調控其介導的MAPK信號通路[12]。Rab5和Rab21是Rab蛋白家族中2個重要的成員，研究表明，Rab5和Rab21均與α-整合素相關，并且可以調節EGFR的內吞作用，從而影響信號通路的傳導[13-15]。EGFR蛋白表達及Rab對其信號傳導通路與臨床關聯性研究鮮見報道。本研究通過檢測宮頸癌中EGFR和Rab5a、Rab21蛋白表達，探討Rab5a、Rab21及EGFR與宮頸鱗癌臨床特征和近期療效的關系。

表4　單因素分析影響總體客觀有效率RR的因素

表5　宮頸鱗癌患者3個月近期療效的多因素分析結果

EGFR過表達是宮頸鱗癌的重要生物學特征。Li等[7]研究顯示在CSCC中EGFR陽性表達率為79.17%(19/24)，周素英等[8]研究顯示在CSCC中EGFR陽性表達率是78.26%(54/69)。Iida等[9]研究顯示，CSCC中EGFR蛋白過表達(++/+++)率為37%(22/59)。本研究顯示，EGFR蛋白陽性表達率為70.0%(42/60)，EGFR蛋白過表達(++/+++)率為55%(33/60)，與以上報道結果接近。關于EGFR表達與HPV感染關系無關的報道居多[10-11]，本研究也顯示HPV感染與EGFR無關。

A: EGFR表達(-)

B: EGFR表達(+)

C: EGFR表達(++)

D: EGFR表達(+++)

圖1EGFR蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(陽性顆粒位于胞膜和胞漿)(SP染色×100)

A: Rab5a表達(-)

B: Rab5a表達(+)

C: Rab5a表達(++)

D: Rab5a表達(+++)

圖2Rab5a蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(陽性顆粒位于胞膜和胞漿)(SP染色×100)

A: Rab21表達(-)

B: Rab21表達(+)

C: Rab5a表達(++)

D: Rab21表達(+++)

圖3Rab21蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(陽性顆粒位于胞膜和胞漿)(SP染色×100)

周素英等[8]報道，EGFR蛋白表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及淋巴脈管間隙浸潤相關(P<0.05)。王亞萍等[16]報道EGFR蛋白表達與宮頸鱗癌淋巴結轉移有關(P=0.01)。Scambia等[17]研究表明EGFR蛋白表達與宮頸癌臨床分期有關(P<0.05)。Pérez-Regadera等[18]研究指出EGFR過表達與年齡無關(P>0.05)。本研究CSCC中EGFR蛋白表達與臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移有關(P=0.006、0.005、0.000)，與年齡無關(P=0.875)，這與以上文獻研究結果相似。

已有研究報道，Rab5a、Rab21蛋白在調節早期內吞體通路中起到作用，但對MAPK信號傳導通路的調控作用卻不盡相同[14，19-20]。Liu 等[20]對CSCC組織及HeLa細胞株的研究顯示Rab5a存在高表達，能促進癌細胞的能動擴散性和侵襲性，且上調MAPK信號傳導通路。Yang等[14]研究驗證Rab21能夠促進宮頸癌HeLa細胞表面的EGFR內吞，與EGFR共定位，通過促進其降解，抑制EGFR介導的MAPK信號通路。本研究顯示EGFR與Rab5a蛋白表達呈正相關(r=0.428，P=0.001)，與Rab21蛋白表達呈負相關(r=-0.300，P=0.020)，提示CSCC中Rab5a蛋白在MAPK信號傳導通路中可能發揮正性調節作用，Rab21蛋白在MAPK信號傳導通路中可能發揮負性調節作用，與文獻[14,20]研究結果相符。Rab5a、Rab21蛋白與CSCC臨床特征相關性研究未見報道。Sheng等[21]研究報道Rab5a與肝癌細胞增殖及轉移有關。本研究中CSCC中Rab5a蛋白表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移有關(P=0.002、0.000)；Rab21蛋白表達與腫瘤分化程度、腫瘤直徑、淋巴結轉移有關(P=0.001、0.044、0.027)，與年齡、民族、HPV感染、臨床分期無關(P>0.05)，提示Rab5a、Rab21蛋白表達可能與CSCC的轉移、預后有關。

綜上所述，EGFR蛋白表達可能是CSCC高危進展的參考指標；Rab5a在EGFR介導的信號傳導通路中可能發揮正性調節作用；Rab21在EGFR介導的信號傳導通路中可能發揮負性調節作用；聯合檢測EGFR、Rab5a、Rab21可能為CSCC診斷、轉移及個體化療法提供理論依據。

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(本文編輯周芳)