新疆特高發(fā)腫瘤資源庫(kù)中冷凍組織質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn)的研究

通信作者：王喜艷，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：胰腺腫瘤的基礎(chǔ)和臨床，E-mail: wangxiyan2415@163.com。

新疆特高發(fā)腫瘤資源庫(kù)中冷凍組織質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn)的研究

郭文佳， 朱琳， 張園， 董翔， 葛慧, 王喜艷

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院新疆腫瘤防治研究所， 烏魯木齊830011)

摘要：目的在新疆特高發(fā)腫瘤資源庫(kù)中建立冷凍組織質(zhì)量鑒定體系。方法選取腫瘤資源庫(kù)中食管癌、宮頸癌、肝癌冷凍組織及正常對(duì)照組織各10例，利用HE染色技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本取材的準(zhǔn)確性，瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，Western-blot鑒定蛋白質(zhì)質(zhì)量。結(jié)果HE染色觀察檢測(cè)標(biāo)本腫瘤部分占80%以上， 28s/18s為1.8～2.0，蛋白質(zhì)及DNA質(zhì)量均完整無(wú)降解。結(jié)論建立了一個(gè)規(guī)范化的冷凍組織質(zhì)量控制體系，可以作為腫瘤資源庫(kù)標(biāo)本質(zhì)量鑒定的常規(guī)方法。

關(guān)鍵詞：腫瘤資源庫(kù)； 冷凍組織； 質(zhì)量鑒定

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81460361); 烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(Y111310045)

作者簡(jiǎn)介：郭文佳(1984-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：哈薩克族食管癌發(fā)病機(jī)理。

中圖分類號(hào)：R197.324

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.002

[收稿日期：2014-11-19]

On the quality identify for frozen tissues from the Xinjiang tumor

resource bank

GUO Wenjia, ZHU Lin, ZHANG Yuan, DONG Xiang, GE Hui, WANG Xiyan

(TumorResearchInstitute,TumorAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a standard protocol for quality control of frozen tissues in the Xinjiang-Tumor Resource Bank. MethodsTen frozen tissues and normal control tissues of cervical cancer esophagus cancer and hepatocellular carcinoma were respectively randomly selected，stained with HE and pathologically checked. Agarose electrophoresis was used to detect the quality of the DNA. Agarose electrophoresis used to check the RNA quality. Western blot was used to detect the quality of the protein from these frozen tissues. ResultsHE staining showed that all the detected samples contained 80% or greater tumor. 28s/18s ratio were respectively 1.8-2.0. The good quality of the protein and DNA from these frozen tissues was observed. ConclusionWe have established a standard quality control system, which is applicable as a routine method in quality control of frozen tissues from the tumor resource bank.

Key words: tumor resource bank; frozen tissue; quality identify

目前在世界范圍內(nèi)開(kāi)始進(jìn)行腫瘤分子分型和個(gè)體化診治的研究[1]。這項(xiàng)研究能否獲得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展取決于一個(gè)最基本的問(wèn)題，即研究用生物樣本的質(zhì)量和數(shù)量，包括符合臨床診治規(guī)范的臨床研究隊(duì)列，高質(zhì)量、嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化操作流程(standard operation procedure，SOP)收集的組織樣本和詳細(xì)的臨床、病理、治療和隨訪等資料[2-3]。高質(zhì)量的腫瘤組織標(biāo)本在腫瘤的科學(xué)研究過(guò)程中扮演了至關(guān)重要的角色，是開(kāi)展腫瘤科學(xué)研究工作的基礎(chǔ)。為了保護(hù)新疆特高發(fā)腫瘤資源，新疆特高發(fā)腫瘤資源庫(kù)收集和保存新疆常見(jiàn)腫瘤患者的血液、體液和組織標(biāo)本，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量鑒定和科學(xué)地管理，現(xiàn)已初步形成制度化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的腫瘤標(biāo)本收集、存儲(chǔ)和管理體系。為在新疆特高發(fā)腫瘤資源庫(kù)中建立冷凍組織質(zhì)量鑒定體系，本研究以新疆特高發(fā)腫瘤資源庫(kù)-80℃低溫下存儲(chǔ)的冷凍組織標(biāo)本為材料，總結(jié)出一整套完整的冷凍組織標(biāo)本質(zhì)量鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本的留取選取新疆特高發(fā)腫瘤資源庫(kù)2011年1月-2013年12月-80℃低溫冰箱中凍存的食管癌、宮頸癌、肝癌冷凍組織標(biāo)本各10例，選取的組織標(biāo)本包括腫瘤組織和遠(yuǎn)端正常組織。

1.2HE染色冷凍組織標(biāo)本先放置在室溫中解凍，標(biāo)本庫(kù)工作人員對(duì)組織標(biāo)本塊進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片操作、HE染色。由病理科資深診斷醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行病理學(xué)檢查，確認(rèn)取材部位與病理診斷是否一致，檢測(cè)組織標(biāo)本的代表性，腫瘤部分在80%以上為合格標(biāo)本。

1.3DNA抽提與鑒定冷凍組織總DNA抽提參照百泰克生物工程有限公司提供的基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。基因組DNA提取以后，利用全波長(zhǎng)分光光度計(jì)檢測(cè)稀釋過(guò)的DNA提取物A值，并根據(jù)測(cè)定時(shí)DNA稀釋比例換算提取DNA濃度，總DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀下觀察冷凍組織標(biāo)本DNA的完整性。

1.4RNA抽提與鑒定冷凍組織總RNA提取參照Sigma公司提供的Trizol 試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。全波長(zhǎng)分光光度計(jì)測(cè)定經(jīng)稀釋的RNA提取物的A 值，根據(jù)測(cè)定RNA提取物的稀釋比例換算出提取RNA濃度。判斷RNA純度的標(biāo)準(zhǔn)：A260/ A280為1.8～2.0。總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)提取RNA的完整性，完整的總RNA顯示明亮的28s和18s條帶，并且28s的亮度是18s的2倍。RT-PCR：將抽提的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，內(nèi)參照選擇GAPDH。GAPDH上游引物：5’-ACGCCAGCGCTCCTAGT-3’， GAPDH下游引物：5’-CGAAGATGACCCGGAAGA-3’。PCR 擴(kuò)增條件：94℃ 3 min；94℃ 3 min，55℃，30 s；72℃，35 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃，5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5蛋白質(zhì)提取與鑒定冷凍組織標(biāo)本蛋白質(zhì)提取：-80℃低溫冰箱中取出冷凍組織標(biāo)本，取約100 mg組織加入細(xì)胞裂解液研磨，放入4℃離心機(jī)， 12 000 r/min 離心30 min，取上清液。Western-blot法鑒定蛋白質(zhì)質(zhì)量：制備SDS-PAGE膠，其中濃縮膠5%,分離膠10%，制備的蛋白樣品放于95℃加熱器中煮沸3 min，蛋白質(zhì)變性。電泳每孔20 μg變性蛋白質(zhì)上樣。濃縮膠使用80 V電壓電泳，分離膠使用100 V電壓電泳。在溫度4℃電壓、100 V的條件下，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)間90 min。結(jié)束后加入1∶1 000稀釋的α-actin單克隆抗體，溫度4℃孵育過(guò)夜。第2天用加入0.1% Tween20的1×TBS洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗人二抗1∶5 000稀釋，在室溫中孵育30 min，洗滌3次后加ECL試劑顯色1 min，立即放入全能型成像系統(tǒng)曝光后觀察結(jié)果。

2結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果所有受檢組織細(xì)胞染色清晰，形態(tài)良好，對(duì)比鮮明(圖1)，腫瘤細(xì)胞比例超過(guò)80%。

A：食管鱗癌

B：宮頸鱗癌

C：肝細(xì)胞癌

圖1管癌、宮頸癌和肝癌組織 HE 染色結(jié)果(×100)

2.2DNA質(zhì)量鑒定30例冷凍組織標(biāo)本的全基因組DNA，電泳可見(jiàn)條帶清晰(圖2)，DNA保存良好。

2.3RNA質(zhì)量鑒定抽提30例冷凍組織標(biāo)本總RNA，各取100 ng，Agilent 2100毛細(xì)管電泳，結(jié)果如圖3所示。28s/18s比值為1.8～2.0，RNA瓊脂糖凝膠電泳以及內(nèi)參照GAPDH RT-PCR，結(jié)果均顯示RNA質(zhì)量好(圖3)。

2.4冷凍組織抽提的蛋白質(zhì)質(zhì)量鑒定應(yīng)用α-actin單抗識(shí)別冷凍組織中相對(duì)應(yīng)的抗原，結(jié)果顯示受檢樣本均可見(jiàn)明顯的目的條帶(圖4),提示受檢冷凍組織蛋白保存良好。

圖2　冷凍組織標(biāo)本DNA電泳

3討論

本研究介紹了新疆特高發(fā)腫瘤資源庫(kù)中冷凍組織標(biāo)本的質(zhì)量鑒定流程，使用這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化流程對(duì)腫瘤資源庫(kù)自建庫(kù)以來(lái)的冷凍組織標(biāo)本進(jìn)行隨機(jī)抽樣檢查，結(jié)果顯示庫(kù)存標(biāo)本質(zhì)量較好。為保證患者的利益，在保證組織塊足夠用于病理診斷的前提下留取組織標(biāo)本，否則可能導(dǎo)致術(shù)中冰凍報(bào)告失誤，影響術(shù)者的術(shù)中決策和術(shù)后治療指導(dǎo)。腫瘤資源庫(kù)工作人員在遇到某些早期腫瘤患者腫瘤體積小、甚至是原位癌時(shí)，杜絕盲目留取，此時(shí)的最佳處理方式是放棄。

A：RNA瓊脂糖電泳； B：GAPDH RT -PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳

圖4　冷凍組織標(biāo)本的蛋白Western blot結(jié)果

一般術(shù)中標(biāo)本留取操作程序如下：腫瘤資源庫(kù)取材人員首先對(duì)手術(shù)切除的大體標(biāo)本進(jìn)行觀察，確認(rèn)腫瘤的部位與范圍，并在肉眼下與周圍異己組織進(jìn)行鑒別，在大體標(biāo)本離體后的最短時(shí)間內(nèi)切取標(biāo)本；再將標(biāo)本切取成多塊直徑為0.5 cm左右的組織塊，分別裝入已編號(hào)的無(wú)核酶的滅菌凍存管中，迅速置入液氮罐中凍存，半小時(shí)后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱，并進(jìn)行紙質(zhì)標(biāo)本資料登記和信息錄入系統(tǒng)。

腫瘤資源庫(kù)中儲(chǔ)存的冷凍組織，常被用于基因芯片、PCR、Western-blot等多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，因此研究可靠的首要前提是每個(gè)冷凍組織標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞所占的百分比。Sandusky等[4]報(bào)道，作為研究所用的標(biāo)本，腫瘤部分占 65% 以上才能符合要求，本研究將組織切片中腫瘤部分所占整體標(biāo)本的比例80%以上作為標(biāo)本鑒定的主要方案之一[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)，大部分標(biāo)本的RNA樣品A260/ A280為1. 8～2.0，說(shuō)明RNA有較高的純度；電泳可見(jiàn)明顯的28s和18s條帶，而且28s的亮度大約是18s條帶的2倍，說(shuō)明提取的總RNA基本沒(méi)有降解，具有較好的完整性[6-7]。有3例標(biāo)本在取材中離體時(shí)間較長(zhǎng)，提取的RNA樣本A260/A280<1.8，而且電泳顯示28s和18s 2條條帶不清晰，有明顯拖尾，提示RNA已經(jīng)降解，應(yīng)重新提取進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如果結(jié)果相同則對(duì)該標(biāo)本進(jìn)行備注。

總之，本研究介紹一套較為完整的腫瘤資源庫(kù)冷凍組織質(zhì)量鑒定的操作流程，方法經(jīng)典可靠，經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證，能夠保證新疆特高發(fā)腫瘤資源庫(kù)庫(kù)存冷凍組織標(biāo)本用于各項(xiàng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。在今后的發(fā)展中，不僅可以滿足自身研究的需要，還可向其他單位的科研工作者提供高質(zhì)量的冷凍組織標(biāo)本，有利于有效地利用現(xiàn)有的庫(kù)存腫瘤資源，最大程度地促進(jìn)醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展。

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(本文編輯周芳)