盆腔器官脫垂發(fā)病機(jī)制的比較蛋白組學(xué)研究

王靜怡，孫智晶，朱蘭，郎景和，梁碩

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100730）

盆腔器官脫垂（Pelvic Organ Prolapse，POP）是由于盆底支持結(jié)構(gòu)的缺陷、損傷或功能障礙造成的嚴(yán)重影響生活質(zhì)量的一組疾病。在女性一生中，每五個(gè)人就有一個(gè)人由于POP而需要進(jìn)行手術(shù)治療，已成為非常值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。而且隨著人口老齡化，估計(jì)在未來(lái)40年，因脫垂而需要治療的人數(shù)會(huì)翻倍增長(zhǎng)［2］。

POP是多因素參與的復(fù)雜疾病，通常認(rèn)為其與盆底結(jié)締組織和肛提肌的組織形態(tài)學(xué)改變、盆底支持組織的神經(jīng)病理改變、雌激素受體（estrogen receptor，ER）表達(dá)以及一些特定蛋白酶的變化相關(guān)［3］。但是這些改變?cè)诩膊〉陌l(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制不明，這就需要從分子生物學(xué)的角度對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的探索研究。由于蛋白質(zhì)自身特定的活動(dòng)規(guī)律及多樣性，在基因組水平上無(wú)法獲知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)形成、轉(zhuǎn)運(yùn)定位、修飾加工、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用等信息，甚至有很多基因并不會(huì)翻譯成蛋白。蛋白質(zhì)組學(xué)以整個(gè)生物體的全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，一次可檢測(cè)并分離出成千上萬(wàn)種不同的蛋白質(zhì)，有利于發(fā)現(xiàn)新的蛋白和蛋白作用機(jī)制。因此，目前蛋白質(zhì)組學(xué)在研究疾病的發(fā)生機(jī)制以及尋找有效的藥物作用靶點(diǎn)方面得到了廣泛應(yīng)用。本研究將應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選POP患者與正常對(duì)照之間的差異表達(dá)蛋白，并對(duì)其在POP發(fā)生中所起的作用進(jìn)行分析，為POP的診治提供新的思路。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇在本院行子宮切除和盆底重建手術(shù)的POP患者（POP組）10例及同期行全子宮切除術(shù)的婦科良性疾病患者（對(duì)照組）10例。所有病例均滿足：絕經(jīng)至少2 年以上，一年內(nèi)未服用過(guò)激素類藥物，無(wú)功能性卵巢腫瘤等雌激素相關(guān)疾病。既往無(wú)慢性盆腔炎癥、子宮內(nèi)膜異位癥、婦科惡性腫瘤、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等慢性呼吸系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病、盆腔手術(shù)史。此外，病例組及對(duì)照組分別滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：（1）POP組：以子宮脫垂伴隨陰道前后壁膨出為主要表現(xiàn)，脫垂程度在POP-QIII期及以上，不伴有壓力性尿失禁癥狀的女性患者。（2）對(duì)照組：經(jīng)過(guò)陰道檢查無(wú)盆腔器官脫垂，無(wú)壓力性尿失禁癥狀，行開(kāi)腹或陰式全子宮切除的婦科良性疾病患者（如宮頸癌前病變、無(wú)功能卵巢囊腫等）。在月經(jīng)情況、年齡、體重指數(shù)、產(chǎn)次等影響盆底障礙性疾病發(fā)生的重要因素匹配的前提下，兩組患者進(jìn)行配對(duì)，每組各選擇5份標(biāo)本。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.取材：組織標(biāo)本離體后在宮頸旁開(kāi)1cm 的主骶韌帶處取材，大小約0.5cm×0.5cm。用生理鹽水沖凈血液，無(wú)菌紗布擦干后置入-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

2.提取組織總蛋白：普通雙向電泳分離，銀染顯色鑒定蛋白質(zhì)抽提質(zhì)量以及在膠圖上的分布情況，并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法。

3.凝膠掃描：熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)凝膠樣品通過(guò)GE Healthcare公司TyphoonTMVariable Mode Imager激光掃描成像系統(tǒng)掃描，熒光染料分別標(biāo)記POP組、對(duì)照組以及內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行雙向電泳得到雙向熒光差異凝膠圖譜。同時(shí)制作制備膠。對(duì)膠圖進(jìn)行匹配和膠內(nèi)差異分析（Differential In-gel Analysis，DIA），篩選出兩組之間｜AV.Ratio｜≥1.5，P＜0.05的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)。

4.圖像膠內(nèi)差異分析：將差異蛋白質(zhì)點(diǎn)膠內(nèi)酶解后，進(jìn)行質(zhì)譜點(diǎn)樣和質(zhì)譜鑒定，獲得肽質(zhì)量指紋圖（Peptide mass fingerprinting，PMF）。 通 過(guò)MASCOT（Matrix Science，London）檢索軟件驗(yàn)證基質(zhì)輔助激光解吸／離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MOLDI-TOF質(zhì)譜儀，Bruker，美國(guó)）得到的PMF數(shù)據(jù)，鑒定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料采用配對(duì)及非配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。膠圖分析在Protein Table中選取｜Av.Ratio｜≥1.5，P＜0.05的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。

結(jié) 果

一、研究對(duì)象的臨床一般情況

POP組和對(duì)照組兩組患者的年齡、絕經(jīng)時(shí)間、體重指數(shù)、產(chǎn)次經(jīng)t檢驗(yàn)，無(wú)明顯差異（P＞0.05）（表1）。

二、子宮主骶韌帶組織的熒光差異凝膠電泳（DIGE）

1.凝膠掃描結(jié)果：凝膠經(jīng)三種不同波長(zhǎng)的激光掃描后，可得到三個(gè)分別由熒光染料Cy2、Cy3、Cy5（Amersham Biosciences，美國(guó)）標(biāo)記的不同蛋白質(zhì)樣品的圖像及重疊的膠內(nèi)差異圖像。經(jīng)DeCyder軟件分析，在Gel 1檢測(cè)到1 049個(gè)蛋白點(diǎn)，Gel 2檢測(cè)到1 157個(gè)蛋白點(diǎn)，Gel 3檢測(cè)到1 056個(gè)蛋白點(diǎn)，Gel 4檢測(cè)到1 151個(gè)蛋白點(diǎn)，Gel 5檢測(cè)到1 143個(gè)蛋白點(diǎn)。平均檢測(cè)率為1 111±54個(gè)斑點(diǎn)。凝膠間匹配率最低為90.7%，具有較好的敏感性和重復(fù)性。DIGE膠圖掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.圖像膠內(nèi)分析：對(duì)獲得的圖像進(jìn)行膠內(nèi)差異分析，同時(shí)利用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行膠間分析，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，在POP組與對(duì)照組間確認(rèn)豐度差異≥1.5倍，P＜0.05的蛋白質(zhì)點(diǎn)79個(gè)，經(jīng)過(guò)逐一分析并手工確認(rèn)，排除雜質(zhì)或蛋白量極低的點(diǎn)，最終確定33個(gè)在兩組之間有顯著差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，這些蛋白質(zhì)點(diǎn)在POP組均為低表達(dá)，最大下調(diào)倍數(shù)8.5倍。

三、POP患者和對(duì)照組差異蛋白的質(zhì)譜鑒定

1.檢索結(jié)果及質(zhì)譜鑒定：通過(guò)膠內(nèi)酶解、質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，30個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到陽(yáng)性結(jié)果，得分較高，質(zhì)譜信號(hào)好，信噪比高，結(jié)果可信（P＜0.05）。并將30個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的理論分子量和等電點(diǎn)與凝膠上相應(yīng)斑點(diǎn)的分子量和等電點(diǎn)對(duì)比后，排除5個(gè)明顯不符合實(shí)際情況的結(jié)果（膠內(nèi)斑點(diǎn)的實(shí)際分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于鑒定出的蛋白質(zhì)的理論分子量）后，共計(jì)成功鑒定出蛋白質(zhì)25個(gè)，鑒定率達(dá)83.3%。25個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)在POP組中均表達(dá)下調(diào)。多數(shù)蛋白質(zhì)出現(xiàn)重復(fù)鑒定，考慮為蛋白質(zhì)修飾等原因造成。但重復(fù)蛋白質(zhì)點(diǎn)相鄰，且強(qiáng)度變化趨勢(shì)一致，再次證明結(jié)果的可靠性。合并重復(fù)鑒定的蛋白，獲得半凝乳素-1、親環(huán)素蛋白A、絲切蛋白等差異蛋白（表2）（圖2）。

圖1 POP組與對(duì)照組的2D-DIGE圖譜

表1 研究對(duì)象的一般情況（±s）

表1 研究對(duì)象的一般情況（±s）

注：＊所有患者均為陰道分娩

組 別 例數(shù) 年齡（歲） 絕經(jīng)時(shí)間 BMI（kg／m2） 產(chǎn)次＊POP組5 66.6±10.2 13.6±10.8 24.4±2.1 2.0±1.0 5 66.6± 7.8 15.8±11.3 23.9±3.0 1.8±0.8對(duì)照組

表2 主要差異蛋白列表

2.差異表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位和功能分析：對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)，根據(jù)Swiss-Prot庫(kù)的注釋信息進(jìn)行功能和細(xì)胞定位分析。本試驗(yàn)篩選出的差異蛋白共涉及118 個(gè)GO 分類，其中與生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分相關(guān)的GO 分類分別為52、41、25個(gè)，分別占44.07%、34.75%、21.19%。多個(gè)GO 分類發(fā)生了顯著變化（P＜0.05）。

討 論

一、研究對(duì)象和實(shí)驗(yàn)材料的選擇

通常認(rèn)為盆腔器官脫垂來(lái)源于支持結(jié)構(gòu)的損傷。盆底支持結(jié)構(gòu)主要包括韌帶、肌肉和筋膜，整體理論中陰道支持結(jié)構(gòu)三個(gè)水平：水平Ⅰ為上層支持結(jié)構(gòu)，主要為主韌帶-宮骶韌帶復(fù)合體；水平Ⅱ?yàn)榕詡?cè)支持結(jié)構(gòu)，主要是肛提肌群及膀胱、直腸陰道筋膜；水平Ⅲ為遠(yuǎn)端支持結(jié)構(gòu)，主要是會(huì)陰體及括約肌。主韌帶-宮骶韌帶復(fù)合體是盆腔器官的最上層支持結(jié)構(gòu)，為主要支持結(jié)構(gòu)，其生物學(xué)狀態(tài)的改變與POP 的發(fā)生密切相關(guān)。同時(shí)，在子宮切除手術(shù)中，主韌帶-宮骶韌帶復(fù)合體的獲得并不會(huì)額外增加對(duì)患者盆底支持結(jié)構(gòu)的損傷，因此相比于肛提肌等其他支持結(jié)構(gòu)，主骶韌帶復(fù)合體更適合作為研究標(biāo)本。

大量研究證明［4-5］，年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、陰道分娩、高體重指數(shù)（BMI）等是POP 發(fā)生的危險(xiǎn)因素。因此，為了排除這些已知的危險(xiǎn)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，本研究嚴(yán)格控制研究對(duì)象的入組和排除標(biāo)準(zhǔn)，使POP組與對(duì)照組研究對(duì)象在各方面相匹配。研究表明POP與絕經(jīng)后雌激素低下?tīng)顟B(tài)密切相關(guān)［6］，因此在研究對(duì)象的排除標(biāo)準(zhǔn)中除外合并子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜病變等受雌激素影響疾病的患者。

二、差異表達(dá)蛋白的功能分析及其與POP的相關(guān)性

在本研究中，POP 組患者主骶韌帶中半凝乳素-1含量較對(duì)照組下調(diào)，差異倍數(shù)達(dá)4.06倍，目前尚缺少半凝乳素在POP的發(fā)生中作用機(jī)制的報(bào)道。半凝乳素（galectin）是生物體內(nèi)廣泛存在的一類糖結(jié)合蛋白，屬于凝集素家族，迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了14個(gè)成員［7］。近年來(lái)，半凝乳素-1在神經(jīng)損傷修復(fù)中所起的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)。Gaudet等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，半凝乳素-1 在大鼠脊髓損傷修復(fù)中起到作用，在未受損的脊髓中，無(wú)半凝乳素表達(dá)，在脊髓損傷后，半凝乳素表達(dá)顯著上調(diào)，尤其是受損節(jié)段。半凝乳素通過(guò)改善趨向受損部位的巨噬細(xì)胞的功能，可以促進(jìn)受損外周軸突的再生。Sasaki等［9］發(fā)現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)中，半凝乳素-1能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后抑制神經(jīng)元的凋亡和星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，同時(shí)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化以及突觸可塑性的形成起重要作用。半凝乳素-1 對(duì)周圍神經(jīng)同樣具有促進(jìn)損傷后修復(fù)的作用。研究報(bào)道［10-11］，氧化狀態(tài)下的半凝乳素-1能夠刺激巨噬細(xì)胞分泌軸突再生促進(jìn)因子，促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后軸突及樹(shù)突再生。Kadoya等［12］研究發(fā)現(xiàn)。切斷坐骨神經(jīng)的大鼠通過(guò)微量滲透泵給予氧化型半凝乳素-1后，能夠促進(jìn)其手術(shù)部位的神經(jīng)再生，同時(shí)也促進(jìn)受損神經(jīng)功能的恢復(fù)［13］。提示半凝乳素-1在神經(jīng)損傷和再生的早期階段可能發(fā)揮了重要作用。

神經(jīng)支配與肌肉功能關(guān)系密切。而半凝乳素-1在促進(jìn)受損神經(jīng)恢復(fù)的同時(shí)，也能夠通過(guò)促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)，恢復(fù)受損部位肌肉的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)，從而調(diào)節(jié)新生骨骼肌中肌小管的生長(zhǎng)，使肌肉恢復(fù)正常的功能和結(jié)構(gòu)［14］。在POP 的發(fā)病機(jī)制研究中，之前的差異基因研究表明，POP與盆底組織的失神經(jīng)支配狀況關(guān)系密切［15］。在本研究中，POP組患者主骶韌帶中半凝乳素-1含量較對(duì)照組下調(diào)，可推測(cè)POP患者體內(nèi)存在半凝乳素-1不足。半凝乳素-1 的不足一方面會(huì)導(dǎo)致患者神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化能力下降，分化成神經(jīng)元的細(xì)胞減少，使POP患者盆底支持組織的神經(jīng)支配較正常人群減少，盆底支持組織功能減弱。另一方面，在腹壓增高、分娩等盆底支持結(jié)構(gòu)受到損傷的情況下，由于半凝乳素-1 缺乏，則無(wú)法促進(jìn)受損神經(jīng)的修復(fù)和再生，使盆底組織失神經(jīng)支配長(zhǎng)期存在，引起并加重POP。

在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，POP組患者親環(huán)素A 含量相比于對(duì)照組下調(diào)，最大差異倍數(shù)達(dá)2.27倍。親環(huán)素A 具有許多重要的生物學(xué)功能，研究發(fā)現(xiàn)大鼠的神經(jīng)細(xì)胞以及其他組織細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激以及缺血缺氧等損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的親環(huán)素A 表達(dá)明顯升高，并且通過(guò)受體CDl47介導(dǎo)的有絲分裂活化蛋白激酶ERKl／2信號(hào)通路，發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，減少細(xì)胞凋亡［16-18］。在血管平滑肌細(xì)胞中環(huán)孢素A 的分泌，能夠刺激平滑肌細(xì)胞的增殖和炎性細(xì)胞移行，促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡，發(fā)揮在心血管事件氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)作用［19］。可見(jiàn)親環(huán)素A 表達(dá)的升高是一種內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制，參與細(xì)胞損傷的應(yīng)答。考慮與半凝乳素-1一樣，在盆底支持結(jié)構(gòu)受到損傷的情況下，由于親環(huán)素A 缺乏，導(dǎo)致對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用不足，使盆底組織失神經(jīng)支配，最終導(dǎo)致POP的發(fā)生。

絲切蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白參與早老性癡呆、帕金森氏病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展。絲切蛋白肌動(dòng)蛋白復(fù)合體在線粒體損傷應(yīng)答中形成最初的神經(jīng)保護(hù)反應(yīng)，但是當(dāng)應(yīng)激持續(xù)存在時(shí)，則會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)元功能的損傷和喪失。可見(jiàn)絲切蛋白肌動(dòng)蛋白復(fù)合體的調(diào)節(jié)異常和功能障礙在神經(jīng)退行性病變發(fā)生發(fā)展中可能起到促發(fā)作用［20］。本研究中絲切蛋白下調(diào)2.02倍，也考慮可能與盆底支持組織中的神經(jīng)損傷修復(fù)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過(guò)雙向差異凝膠電泳、質(zhì)譜鑒定以及生物信息學(xué)方法，對(duì)POP 患者的主骶韌帶中蛋白質(zhì)的表達(dá)特征進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)了在POP組中顯著下調(diào)的蛋白，并涉及多個(gè)功能分類，提示POP的發(fā)生涉及了復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制，并推測(cè)神經(jīng)的損傷修復(fù)可能與POP的發(fā)病密切相關(guān)。進(jìn)一步需要增加樣本量進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，明確差異蛋白在POP盆底支持組織的表達(dá)，并進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

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