miR-133a對滋養層細胞系HTR8-SVneo的粘附及侵襲功能的影響

劉媛，李博，陳書強，王東，孫惠君，董杰，周晶，郭雯娓，王曉紅

（第四軍醫大學唐都醫院婦產科，西安 710038）

復發性自然流產（RSA）指連續發生3次或者以上自然流產［1］。其發病率占到不孕不育人群的10%～15%［2-3］，引起RSA 的病因各異，如染色體異常、內分泌異常、免疫因素感染因素和解剖因素等，但約有50%RSA 原因不明［4］，因此治療效果欠佳，嚴重影響了廣大婦女的生殖健康。微小RNA 分子（microRNA，miRNA）是廣泛分布于動植物細胞體內，是一類內源性非編碼的小分子RNA。我們課題組前期研究發現，人絨毛組織中miR-133a的高表達與RSA 的發生顯著相關［5］，但具體的調控機制仍有待進一步證實。本文擬研究miR-133a對HTR8-SVneo細胞黏附和侵襲能力的影響，為臨床干預提供理論依據和新的靶點。

材料與方法

一、實驗材料

1.細胞系：人類滋養層細胞系HTR8-SVneo由本實驗室保存。

2.主要試劑及儀器：miR-133a的mimics、inhibitor、無義序列（上海吉瑪），脂質體Lipfectamine 3000（Invitrogen，美國），DMEM／F12（1：1）培養基（Hyclone，美國），胎牛血清（Gibco，美國），Matrigel膠（BD，美國），光學顯微鏡、酶標儀、熒光定量PCR分析儀（伯樂，美國）。

二、研究方法

1.細胞培養：HTR8-SVneo 細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM／F12（1：1）培養基中，細胞置于5%CO2、95%濕度、37 ℃的培養箱中培養。

2.細胞轉染及分組：按照Lipfectamine 3000說明書進行轉染，轉染前1d接種適量HTR8-SVneo細胞于6孔板中，細胞融合度達到50%～70%時轉染miR-133a的mimics、inhibitor、無義序列。以無義序列為空白對照。miR-133a的mimics序列為 5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3’，miR-133a 的 inhibitor 序 列 為 5 ’-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3’，無義序列 為：5’-U UGUACUACACAAAAGUACUG-3’。轉染48h后，收集各組HTR8-SVneo細胞進行以下實驗。

3.實時熒光RT-PCR 技術檢測各組HTR8-SVneo中miR-133a的表達：轉染后48h 后，采用miRNA 提取試劑盒（lifetechnologes，美國）提取各組細胞的總RNA，紫外分光光度儀測定RNA 濃度后，按照RT 試劑（上海吉瑪）說明書合成cDNA。miR-133a的引物序列，以U6 為內參，引物序列見表1。引物由上海吉瑪公司合成。參照實時熒光RT-PCR 試劑盒（上海吉瑪）說明書配制實時定量PCR 反應體系，每個體系為20μl。PCR 反應條件如下：95 ℃，3min；95 ℃12s，60 ℃40s，40個循環。具體操作按說明書進行。以2△△t方法計算目的基因的表達水平，實驗重復3次。

表1 PCR 實驗引物序列

4.MTT 法檢測細胞黏附能力：鋪每孔2μg層粘連蛋白（LN）于96 孔板中，室溫干燥后，用2%BSA 的磷酸鹽緩沖液（PBS）20μl 37 ℃封閉1h，PBS洗3 次，每孔加入5×104個轉染后48h 的HTR8-SVneo細胞，5%CO2、95%濕 度、37 ℃培 養箱中培養1.5h后，PBS輕輕洗2次，洗去未黏附細胞，棄去殘余PBS，每孔加入20μl MTT（5mg／ml），于細胞培養箱中繼續培養4h，棄上清，每孔加入150μl二甲基亞砜（DMSO）溶液，震蕩混勻后，于酶標儀上測定550nm 處OD 值，實驗重復5次。按下式計算藥物對細胞的抑制率（IR）：

IR（%）＝（1—實驗組平均OD 值／對照組平均OD 值）×100%。黏附率＝（1-抑制率）×100%。

5.Transwell法測細胞侵襲能力：Transwell小室的上下室之間以孔徑為8μm 的聚碳酸酯膜孔分隔開，濾膜上層鋪蓋人工基底膠（Matrigel，BD，美國）。室溫過夜干燥。在小室中加入100 μl 的DMEM 培養液，置于孵箱中孵育2h，使Matrigel水化。用0.25% 胰蛋白酶消化預先轉染48h 的HTR8-SVneo細胞，800r／min離心5 min，收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，最后用2% DMEM 培養基重懸細胞，調整細胞數為5×105個／ml。吸出小室內的培養基，洗去500μl含10%血清的DMEM于下室中作為趨化因子，加100μl細胞懸液于內室中，5%CO2、95% 濕度、37℃的培養箱中培養24h。取出Transwell小室，吸除培養基，用棉簽擦拭凈Transwell小室濾膜上層的Matrigel及未穿過濾膜的細胞。將小室侵入4% 的多聚甲醛中固定10min，風干后于蘇木素染色液中染色20 min，采用蒸餾水沖洗，實驗中每組每次同時做3個重復小室，顯微鏡下觀察計數，取平均值。

三、統計學分析

結 果

一、轉染后各組miR-133a表達

運用實時熒光定量PCR 檢測各組轉染后miR-133a的表達情況，結果發現：轉染mimics的上調組miR-133a的表達明顯高于對照組（NC），轉染inhibitor的下調組miR-133a的表達明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 轉染后各組miR-133a的表達

二、MTT 法檢測轉染后各組細胞黏附能力的變化

轉染mimics的上調組細胞黏附能力較對照組顯著降低（P＜0.05），轉染inhibitor的下調組細胞的黏附能力較對照組顯著升高（P＜0.05）（表2）。

表2 miR-133a對滋養細胞黏附能力的影響［（

三、Transwell實驗檢測轉染后各組細胞侵襲力的變化

通過比較各組細胞穿過人基質膠細胞數量的多少，評估各組細胞的侵襲能力，每組取5個高倍鏡視野。結果顯示：轉染mimics的上調組細胞侵襲能力較對照組顯著降低（P＜0.01），轉染inhibitor的下調組細胞的侵襲能力較對照組顯著升高（P＜0.01）（圖2）。

圖2 轉染后各組細胞侵襲能力的變化。A、B、C分別為NC、inhibitor、mimics各組光學顯微鏡下觀察圖像 蘇木素染色 ×200；D：各組細胞侵襲能力統計學直方圖。

討 論

妊娠過程中，胎盤絨毛外滋養層細胞在囊胚著床后便開始分化遷移，向子宮脫膜層和基層血管侵襲，啟動螺旋動脈的重塑過程［6］，這一過程是建立母胎循環的關鍵。絨毛外滋養層細胞具有的侵襲功能是保證子宮螺旋動脈重塑和妊娠順利完成的重要基礎。滋養層是獨特的上皮細胞，滋養層細胞的侵潤能力與其粘附能力是緊密關聯［7］。miRNAs作為生物體重要的基因調控分子，在不同生理、病理期以及不同的組織細胞類型中，miRNAs的表達豐度不同［8］。miRNAs的異常表達可能與多種疾病的發生相關［9-14］。

前期研究提示：miR-133a在RSA 患者流產絨毛中表達量顯著上調。但是其具體的表達調控機制尚不清楚。本研究首先采用脂質體轉染降調或者上調滋養層細胞系中miR-133a的表達，并通過實時熒光定量PCR 檢測其轉染結果，采用MTT 法研究miR-133a對滋養層細胞粘附，同時利用Transwell方法檢測miR-133a對滋養層細胞侵襲的影響，結果顯示下調miR-133a的表達，能增強HTR8-SVneo細胞的黏附能力，以及侵襲能力。而上調miR-133a的表達，細胞的黏附能力和侵襲能力均降低。體外實驗與前期的研究結果分析，說明復發性自然流產患者可能存在某種機制致使滋養層細胞中miR-133a表達量上調，導致細胞粘附及侵襲功能降低，而導致流產。

綜上所述，miR-133a在調控滋養層細胞粘附和侵襲方面發揮重要作用，很可能成為復發性自然流產侵襲的新的調節基因，為復發性自然流產臨床基因治療提供新的靶點。

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