定量熒光PCR在肺炎支原體肺炎診斷中的應用

虞靜芳

（蘇州市吳江區第一人民醫院，江蘇 蘇州 215200）

定量熒光PCR在肺炎支原體肺炎診斷中的應用

虞靜芳

（蘇州市吳江區第一人民醫院，江蘇 蘇州 215200）

目的研究定量熒光PCR在支原體肺炎診斷中的價值。方法選取2012年1月至2012年12月938例肺炎住院患兒，進行定量熒光PCR、支原體抗體等多檢查，明確MP感染。結果412（36.2%）例診斷為MP肺炎，278例患兒PCR陽性，高MP拷貝數的比例隨著患兒的年齡增大而增大（P＜0.01），高MP拷貝數組的患兒發熱率高于低MP拷貝數組（P＜0.01）；高MP拷貝數組的患兒喘息發生率高于低MP拷貝數組（P＜0.01）。高MP拷貝數組患兒血清學陽性率明顯高于低MP拷貝數組（P＜0.01）。低MP拷貝數組的患兒混合感染率明顯高于高MP拷貝數組（P＜0.01）。結論熒光定量PCR在MP肺炎的診斷中起重要的作用，高MP拷貝數更能提示MP的致病作用，而低MP拷貝數的臨床意義可能不大。

定量熒光PCR；支原體肺炎

肺炎支原體（MP）是小兒時期感染性肺炎的重要病原之一[1]。臨床常運用血清學檢查MP抗體的方法診斷MP肺炎，然而該方法需間隔1～2周的雙份血清MP-IgM測定[2]，一般用于回顧性研究。近年來，PCR被廣泛用于MP感染的早期診斷，尤其對于嬰幼兒或免疫力低下的患兒，PCR有更好的臨床價值[3]。然而痰MP-PCR能出現假陽性，有研究發現支原體感染后患者痰PCR陽性最長可持續7個月，因此臨床上區分支原體現癥感染還是支原體攜帶存在困難。本研究使用定量熒光PCR探討不同滴度PCR在MP肺炎診斷中的應用價值。

1 對象與方法

1.1 對象：選取于2012年1月至2012年12月間因急性呼吸道感染而住我院兒科治療的患兒938例，進行多種病原學檢查，明確MP感染。

1.2 定量熒光PCR和病毒檢測：所有患兒均于入院24 h內采集痰標本，用一次性吸痰管送入患兒鼻腔5～10 cm，利用負壓吸取痰液1～2 mL，痰液標本經震蕩、離心、去上清，加入裂解液提取DNA，再進行PCR擴增。此外，所有痰標本應用直接免疫熒光法檢測呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒-1、2、3和腺病毒抗原。

1.3 MP特異性抗體檢測：本研究MP血清學抗體顆粒凝集法采用日本富士瑞必歐株式會社生產的賽樂迪亞一麥克Ⅱ試劑盒。本實驗首份血清滴度≥1∶160為陽性；雙份血清以MP 抗體滴度4倍及以上升高為確診MP感染。

1.4 MP肺炎的診斷：因肺炎住院的患兒定量熒光PCR陽性或首份血清滴度≥1∶160為陽性或雙份血清以MP抗體滴度4倍及以上升高均診斷為MP肺炎。

1.5 統計學分析：數據用SPSS18.0進行統計分析，各組陽性率比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。計量資料比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MP定量PCR總檢出情況

2.1.1 在938例因呼吸道感染而住院的患兒中，412（36.2%）例診斷為MP肺炎，其中98（8.6%）例為單純PCR陽性診斷患兒，134（11.8%）例為單純血清學診斷患兒，180（15.8%）例PCR及血清學均陽性。在這412例MP肺炎患兒中，214（51.9%）例男性，198（48.1%）例女性，平均年齡為37個月（極差，1～145個月）。

2.1.2 在412例MP肺炎患兒中，278（67.5%）例患兒PCR陽性，PCR檢測范圍為＜2500拷貝/毫升至＞2.5×107拷貝/毫升，我們將PCR拷貝數分為兩組：高MP拷貝數組（＞10拷貝/毫升）（n=141）和低MP拷貝數組（＜106拷貝/毫升）（n=137）。高MP拷貝數的比例隨著患兒的年齡增大而增大（P＜0.01）。

2.2 MP定量PCR月檢出率分布情況：MP定量PCR陽性率在夏季（6～8月）達到高峰，且高MP拷貝數的檢出率也在夏季檢出率最高，1～3月高MP拷貝數人數為7例（13.5%），4～6月為32例（25.2%），7～9月為76例（49.6%），10～12月為26例（31.2%）。而低MP拷貝數組則無明顯四季差異性。

2.3 不同拷貝數MP定量PCR的臨床特點比較：MP定量PCR不同拷貝數的臨床特點見表1。高MP拷貝數組的患兒年齡大于低MP拷貝數組[51±52）個月vs （26±29）個月，P＜0.01]；高MP拷貝數組的患兒發熱率高于低MP拷貝數組（78.7% vs 58.7%，P＜0.01）；高MP拷貝數組的患兒喘息發生率高于低MP拷貝數組（15.8% vs 35.8%，P＜0.01）。

2.4 不同拷貝數MP定量PCR的血清學抗體比較：在這278例PCR陽性的MP肺炎患兒中，147例入院時血清學檢測陽性，其中高MP拷貝數組有98例，低MP拷貝數組有49例，高MP拷貝數組患兒血清學陽性率明顯高于低MP拷貝數組（P＜0.01）。入院時，高MP拷貝數組患兒血清學抗體幾何平均滴度隨年齡的增加呈遞增趨勢，而低MP拷貝數組隨著年齡的增大變化不大。

2.5 不同拷貝數MP定量PCR的混合感染比較：在這278例PCR陽性的MP肺炎患兒中，176（63.3%）例患兒存在混合感染，即存在MP以外的其他病原學依據，98例合并病毒感染，78例合并細菌感染。低MP拷貝數組的患兒混合感染率明顯高于高MP拷貝數組（28.1% vs 8.9%，P＜0.01）。

3 討 論

MP感染主要引起呼吸系統疾病。MP經飛沫傳染，潛伏期以及病程長，臨床癥狀消失后仍可持續帶病原體數月。MP首次感染后可存在于呼吸道上皮細胞內長達數月之久，可發展為無癥狀攜帶者[4]。

目前臨床上應用最為廣泛的檢測方法是血清特異性抗體的檢測，如顆粒凝集法，酶聯免疫法等。由于MP-IgM于感染后7～10 d產生，因此在病程早期（如1周內）檢測MP特異性抗體常會出現假陰性。而雙份血清學檢測雖能避免假陰性結果，但由于第2份血清采集時間長在第1次后的1～2周后，臨床上廣泛應用并不實際。此外，對于免疫系統發育未成熟及存在免疫缺陷的患兒MP-IgM的檢測同樣存在一定的局限性[5]。

表1 支原體定量PCR不同拷貝數的臨床特點比較.

近年來隨診檢驗水平的提高，熒光PCR的應用，使臨床醫師能在早期診斷MP肺炎。我們的研究發現年齡越大，其感染MP時拷貝數越高，而在嬰幼兒MP拷貝數則較低，拷貝數越高，越提示支原體感染，這與MP在學齡前期兒童及學齡期兒童的致病力較強一致。

在此次研究的278例PCR陽性的MP肺炎患兒中，147（52.9%）例血清學檢測陽性。而在這147例血清學檢測陽性的患兒中，多數患兒PCR為高MP拷貝數（98/147）；且在不同年齡段，高MP拷貝數患兒隨著年齡的增長呈增長趨勢。此外高MP拷貝數組的患兒混合感染率明顯低于低MP拷貝數患兒（8.9%），說明高MP拷貝數提示MP在此次肺炎中的致病作用，而低MP拷貝數患兒血清學檢測陰性率高，且常存在混合感染，提示低MP拷貝數可能在此次肺炎中的臨床意義不大，應警惕MP污染或攜帶。

綜上所述，熒光定量PCR在MP肺炎的診斷中起重要的作用，高MP拷貝數更能提示MP的致病作用，而低MP拷貝數的臨床意義可能不大。

[1]Michelow IC,Olsen K,Lozano J,et al.Epidemiology and clinical characteristics of community-acquired pneumonia in hospitalized children[J].Pediatrics,2004,113(4):701-707.

[2]Bradley JS,Byington CL,Shah SS,et al.Executive summary:the management of community-acquired pneumonia in infants and children older than 3 months of age:clinical practice guidelines by the Pediatric Infectious Diseases Society and the Infectious Diseases Society of America[J].Clin Infect Dis,2011,53(7):617-630.

[3]Kim NH,Lee JA,Eun BW,et al.Comparison of polymerase chain reaction and the indirect particle agglutination antibody test for the diagnosis of Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children during two outbreaks[J].Pediatr Infect Dis J,2007,26(10):897-903.

[4]Nilsson AC,Bjorkman P,Persson K.Polymerase chain reaction is superior to serology for the diagnosis of acute Mycoplasma pneumoniae infection and reveals a high rate of persistent infection[J]. BMC Microbiol,2008,8(1):93.

[5]He XY,Wang XB,Zhang R,et al.Investigation of Mycoplasma pneumoniae infection in pediatric population from 12,025 cases with respiratory infection[J].Diagn Microbiol Infect Dis, 2013,75 (1):22-27.

R725；R563.1

B

1671-8194（2015）05-0070-02