菌落直徑法和菌絲干重法在優(yōu)化真姬菇菌種固體斜面培養(yǎng)條件的比較*

孫 磊，程顯好，李維煥，歐勝平，楊 濤

（魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025）

菌落直徑法和菌絲干重法在優(yōu)化真姬菇菌種固體斜面培養(yǎng)條件的比較*

孫 磊，程顯好**，李維煥，歐勝平，楊 濤

（魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025）

為了優(yōu)化真姬菇菌種培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件，對表征菌絲生長狀況的菌落直徑擴(kuò)散法和菌絲干重法進(jìn)行了比較，結(jié)果菌落直徑擴(kuò)散法和菌絲干重法結(jié)果有較大差別，菌落直徑擴(kuò)散法并不能真正反映菌絲的生物量。

真姬菇；菌落直徑擴(kuò)散法；菌絲干重法；生物量

真姬菇，又名玉蕈、蟹味菇，享有“聞則松茸，食則玉蕈”的美譽(yù)[1]，是一種營養(yǎng)豐富的食用兼藥用的珍稀食用菌[2]，也是目前進(jìn)入工廠化生產(chǎn)的重要食用菌之一[3]，具有提高人體免疫力，預(yù)防衰老，延長壽命等多種功效[4]，廣受消費(fèi)者的喜愛，也是一種極具潛力的生產(chǎn)品種。

菌種質(zhì)量是真姬菇工廠化生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵因素，菌種質(zhì)量的優(yōu)劣直接關(guān)系到最終產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)[5]。因此，為了食用菌產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，必須對作為生產(chǎn)源頭的菌種的生產(chǎn)條件進(jìn)行優(yōu)化。

運(yùn)用適當(dāng)?shù)姆椒▋?yōu)化選出適合真姬菇菌種生長的最適生長條件，有利于降低生產(chǎn)成本，提高菌種質(zhì)量，從而提高產(chǎn)量。目前，在菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化工作中，固體培養(yǎng)條件下菌絲生長量常用的測定方法為菌落直徑擴(kuò)散法[6－8]，液體培養(yǎng)條件下菌絲生長量測定則多用生物量法（菌絲干重法）[9－10]。固體培養(yǎng)條件下，存在著菌絲難以與培養(yǎng)基分離的問題，所以研究工作中采用菌落直徑擴(kuò)散法較多。但此方法屬于間接法，不一定能真實(shí)反應(yīng)菌絲的生長量，采用這種方法獲得的結(jié)果，容易給生產(chǎn)實(shí)踐造成困擾。

針對培養(yǎng)基與菌絲難分離的問題，通過平板上鋪一層玻璃紙的方式，能防止菌絲在培養(yǎng)基中蔓延，其微小孔徑又不影響培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分傳輸至菌絲，所以可以使菌絲輕易與培養(yǎng)基剝離，便于采用干重法測定生物量。

為比較菌落直徑法和生物量法的利弊，本文以真姬菇為供試菌株，比較了菌落直徑擴(kuò)散法和生物量法測定結(jié)果的差異，以期為今后的科研、生產(chǎn)測定方法的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 供試菌株

真姬菇菌種由魯東大學(xué)菌物科學(xué)技術(shù)研究院菌種室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

GPY固體培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖20 g、蛋白胨6 g、酵母膏10 g、瓊脂10 g，pH 6.0。

PDA固體培養(yǎng)基（1 L）：馬鈴薯200 g（煮汁）、葡萄糖20 g、瓊脂10 g，pH 6.0。

GPC固體培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖20 g、蛋白胨6 g、玉米漿10 g、瓊脂10 g，pH 6.0。

麥芽汁固體培養(yǎng)基（1 L）：每升麥芽汁（固形物5.0%）中加入瓊脂10 g，pH 6.0。

胡蘿卜固體培養(yǎng)基（1 L）：胡蘿卜200 g（煮汁）、葡萄糖20 g、瓊脂10 g，pH 6.0。

麥麩固體培養(yǎng)基（1 L）：麥麩30 g（煮汁）、葡萄糖20 g、K2HPO43 g、MgSO41.5 g、瓊脂10 g，pH 6.0。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

無菌條件下，將保存的真姬菇菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，25℃避光培養(yǎng)5 d～7 d，備用。將活化后的斜面菌種接種于平板的正中央，25℃避光培養(yǎng)9 d～10 d，備用。

1.2.2 菌落直徑測定法

無菌條件下，將活化后平板培養(yǎng)的菌絲用5 mm打孔器沿著外周打孔，取生長最旺盛的平板菌落邊緣菌絲塊。在平板上鋪一層滅菌玻璃紙，然后將菌塊接到6種已鋪好玻璃紙的培養(yǎng)基正中央，25℃避光培養(yǎng)，定期測量菌落直徑大小，每個(gè)平板分別用直尺沿平板底部垂直方向測3次，取平均值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 生物量測定法

無菌條件下，將活化后平板培養(yǎng)的菌絲用5 mm打孔器沿著外周打孔，取生長最旺盛的平板菌落邊緣菌絲塊。在平板上鋪一層滅菌玻璃紙，然后將菌塊接到6種已鋪好玻璃紙的培養(yǎng)基正中央，25℃避光培養(yǎng)，定期進(jìn)行測量。每次取每種培養(yǎng)基的3個(gè)平板進(jìn)行測量，將鋪在培養(yǎng)基上的玻璃紙揭下來，菌絲仔細(xì)刮下，除掉培養(yǎng)基和玻璃紙，菌絲置于干燥箱中60℃烘干至恒重，用電子天平稱量其重量。

1.2.4 pH篩選

培養(yǎng)基設(shè)置pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0六個(gè)梯度，25℃時(shí)，每個(gè)梯度在6種培養(yǎng)基條件下分別培養(yǎng)18個(gè)平板，采用菌落直徑法和生物量法分別測定不同pH情況下菌絲的生長狀況，并進(jìn)行比較。

1.2.5 溫度篩選

培養(yǎng)溫度分別設(shè)置15℃、20℃、25℃、30℃四個(gè)梯度，在pH6.0條件下，每個(gè)溫度梯度在6種培養(yǎng)基條件下分別培養(yǎng)18個(gè)平板，采用菌落直徑法和生物量法分別測定不同溫度條件下菌絲的生長狀況，并進(jìn)行比較。

1.2.6 培養(yǎng)基篩選

分別采用菌落直徑法和菌絲干重法測定菌絲在GPY、PDA、GPC、麥芽汁、胡蘿卜、麥麩6種固體培養(yǎng)基條件下的生長狀況，并進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1兩種菌絲生長測定方法比較pH對菌絲生長的影響

比較培養(yǎng)至第12天時(shí)不同pH下的的菌絲生長量，結(jié)果見表1、表2。

由表1可知，6種培養(yǎng)基中菌絲均在pH6.0的時(shí)候有最大生長直徑，即生長速度最大，生長速度快慢大致表現(xiàn)為麥芽汁固體培養(yǎng)基＞GPY固體培養(yǎng)基＞PDA固體培養(yǎng)基＞胡蘿卜固體培養(yǎng)基＞GPC固體培養(yǎng)基＞麥麩固體培養(yǎng)基。表1中通過對比同一培養(yǎng)基中菌絲在不同pH條件下的生長狀況不難看出，除pH4.5之外，其他pH對生長速度最快的麥芽汁固體培養(yǎng)基中菌絲的影響很小。

由表2可知，不同培養(yǎng)基中，菌絲生長所需pH不同，麥麩、GPY和GPC固體培養(yǎng)基中的菌絲生長受pH的影響較大，其余幾種培養(yǎng)基中的菌絲生長受pH影響較小，其干重情況表現(xiàn)為GPY固體培養(yǎng)基＞GPC固體培養(yǎng)基＞胡蘿卜固體培養(yǎng)基＞PDA固體培養(yǎng)基＞麥麩固體培養(yǎng)基＞麥芽汁固體培養(yǎng)基。其中干重較大的GPY固體培養(yǎng)基和GPC固體培養(yǎng)基中的菌絲在pH6.0時(shí)干重最大。

不同pH條件下菌絲生長狀況差異分析見表3。

表1 菌落直徑法測定的pH對菌絲生長的影響Tab.1 The effect of pH on mycelium growth with the colony diameter diffusion method

表2 生物量法測定的pH對菌絲生長的影響Tab.2 The effect of pH on mycelium growth with dry weight method

表3 不同pH條件下菌絲生長狀況差異分析Tab.3 Analysis of mycelium growth status under different pH

由表3可以看出，pH6.0條件下菌絲的生長狀況與其他pH條件下的菌絲生長狀況相比差異達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），其它pH條件之間雖然有一定差異，但差異沒有達(dá)到顯著水平。說明pH6.0是最適合菌絲生長的pH條件；pH4.5條件下菌絲的生長狀況與其他pH條件下的菌絲生長狀況差異也達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），但這一條件下的菌絲生長緩慢，說明pH4.5是最不適合菌絲生長的培養(yǎng)條件。

2.2兩種菌絲生長測定方法比較溫度對菌絲生長的影響

比較培養(yǎng)至第12天時(shí)不同溫度條件下的的菌絲生長量，結(jié)果見表4、表5。

表4 菌落直徑法測定的溫度對菌絲生長的影響Tab.4 The effect of temperature on mycelium growth with the colony diameter diffusion method

由表4可知，菌絲在4種溫度條件下均能生長，除麥芽汁固體培養(yǎng)基之外，其余幾種培養(yǎng)基中的菌絲對于溫度的需求為25℃＞30℃＞20℃＞15℃，隨著溫度從低到高的變化，菌絲的生長速度大致呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，麥芽汁固體培養(yǎng)基中的菌絲在25℃和30℃條件下生長速度差異不大；15℃條件下菌絲生長緩慢，明顯低于其他溫度條件下菌絲的生長速度，所以不適合作為菌絲培養(yǎng)的溫度。

由表5可知，除麥麩固體培養(yǎng)基之外，其他培養(yǎng)基中菌絲對于溫度的需求為25℃＞20℃＞30℃＞15℃，菌絲干重隨溫度變化也大致呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。相對于表4中麥麩培養(yǎng)基中菌絲的生長速度而言，菌絲干重出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能與操作誤差有關(guān)系，也可能是溫度適宜造成菌絲的徒長，但菌絲致密程度不夠，導(dǎo)致干重降低，具體原因有待進(jìn)一步研究證明。不同溫度中菌絲生長差異的分析見表6。

表5 生物量法測定的溫度對菌絲生長的影響Tab.5 The effect of temperature on mycelium growth with dry weight method

表6 不同溫度中菌絲生長差異顯著性分析Tab.6 Analysis on significant difference of mycelium growth status under different temperature

由表6可以看出，25℃時(shí)菌絲生長與其他溫度條件下菌絲的生長差異達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），所以，25℃是菌絲生長的最適溫度。

2.3兩種菌絲生長測定方法比較培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

比較培養(yǎng)至第12天時(shí)不同培養(yǎng)基條件下的的菌絲生長量，結(jié)果見表7。

表7 不同培養(yǎng)基中菌絲生長狀況差異顯著性分析Tab.7 Analysis on significant difference of mycelium growth status in different culture medium

以菌落直徑法表征菌絲生長速度時(shí)，菌絲在6種培養(yǎng)基中均能生長（表1），其生長速度快慢表現(xiàn)為：麥芽汁固體培養(yǎng)基＞PDA固體培養(yǎng)基＞GPY固體培養(yǎng)基＞胡蘿卜固體培養(yǎng)基＞GPC固體培養(yǎng)基＞麥麩固體培養(yǎng)基。同時(shí)由表7可以看出，麥芽汁固體培養(yǎng)基中的菌絲生長速度與其他培養(yǎng)基條件下的菌絲生長速度相比達(dá)到極顯著的差異（p＜0.01），說明麥芽汁固體培養(yǎng)基和PDA固體培養(yǎng)基是最適培養(yǎng)基；麥麩固體培養(yǎng)基和GPC固體培養(yǎng)基不適宜培養(yǎng)菌絲。

但生物量法的測定結(jié)果與菌落直徑擴(kuò)散法的結(jié)果不一致（表2），6種培養(yǎng)基中菌絲的干重情況由大到小順序?yàn)椋篏PY固體培養(yǎng)基＞GPC固體培養(yǎng)基＞胡蘿卜固體培養(yǎng)基＞PDA固體培養(yǎng)基＞麥麩固體培養(yǎng)基＞麥芽汁固體培養(yǎng)基，由表7可知，GPY和GPC固體培養(yǎng)基中的菌絲干重與其他固體培養(yǎng)基中的菌絲干重相比達(dá)到極顯著差異（p＜0.01）；GPY和GPC固體培養(yǎng)基中的菌絲干重間也有顯著差異，且通過比較表1中2種培養(yǎng)基中的菌絲在同種培養(yǎng)條件下的生長狀況可知，GPY固體培養(yǎng)基中的菌絲生長狀況優(yōu)于GPC固體培養(yǎng)基中的菌絲生長狀況。

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著食用菌產(chǎn)業(yè)化的不斷發(fā)展，生產(chǎn)實(shí)踐對菌種的質(zhì)量提出了更高的要求，通過不同方法優(yōu)化研究菌種培養(yǎng)條件報(bào)道很多，以期獲得保持菌種最佳生長狀態(tài)的條件。吳韶菊[6]等運(yùn)用菌落直徑法，以PDA培養(yǎng)基和玉米粉培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，通過改變碳氮源測定真姬菇的生長狀況，研究得出適于真姬菇菌絲體生長的最適培養(yǎng)基為玉米粉20 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、MgSO41 g、KH2PO41 g、蛋白胨1 g；楊梅等[9]對秀珍菇液體發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以菌絲體生物量為測定指標(biāo)，篩選出秀珍菇菌絲體深層培養(yǎng)的最適碳源為玉米粉，最佳發(fā)酵條件為pH5.0，接種量10%。

菌種生產(chǎn)中，不僅菌絲生長速度要快，菌絲的活力、產(chǎn)量、抗逆性、顏色等標(biāo)準(zhǔn)更加重要。菌落直徑擴(kuò)散法是依據(jù)測量的菌絲蔓延速度作為主要的評價(jià)依據(jù)，蔓延速度快的培養(yǎng)基條件就被認(rèn)為是相對適合的培養(yǎng)條件，這種方法培養(yǎng)的菌種能在相對短的時(shí)間內(nèi)長滿培養(yǎng)基，但是單憑菌絲的蔓延速度無法真正地反應(yīng)菌種的生長狀況，容易重視菌絲的徒長，對菌種的質(zhì)量造成誤判，所育菌種可能存在產(chǎn)量低、抗性弱等問題，對生產(chǎn)實(shí)踐造成困擾；生物量法是依據(jù)菌絲的最終生物量為評價(jià)依據(jù)，生長速度相對快、生物量高的培養(yǎng)基條件為適合的培養(yǎng)條件，這種方法培養(yǎng)的菌種以產(chǎn)量高作為主要標(biāo)準(zhǔn)，不單純追求高的菌絲蔓延速度，更能保證菌種的高活力、強(qiáng)抗性。

以2種菌絲生長測定方法優(yōu)化真姬菇菌種斜面培養(yǎng)基，其結(jié)果在溫度和pH方面沒有差別，但所選培養(yǎng)基的種類差別很大，菌落直徑擴(kuò)散法中得出最適培養(yǎng)條件為25℃、pH6.0、麥芽汁固體培養(yǎng)基，而生物量法得出的結(jié)論為25℃、pH6.0、GPY固體培養(yǎng)基；直徑擴(kuò)散法選出的麥芽汁固體培養(yǎng)基，雖然菌絲生長速度最快，但菌絲稀疏、細(xì)弱、顏色暗淡，不適合作為菌種使用，而生物量法選出的GPY固體培養(yǎng)基中的菌絲濃白健壯，菌落豐厚，邊緣整齊，且生長速度也相對較快，比較符合作為菌種的標(biāo)準(zhǔn)。

通過對比表1、表2中菌絲的生長速度與生物量的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，菌絲生長速度與生物量之間沒有線性相關(guān)關(guān)系。因此，菌絲蔓延的快，不一定質(zhì)量好。

本研究結(jié)果表明，生物量法比較適合優(yōu)化真姬菇菌種的培養(yǎng)條件，同時(shí)，依據(jù)此方法得出的真姬菇菌種的最適培養(yǎng)條件為25℃、pH6.0、GPY固體培養(yǎng)基。

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[5]劉洋.真姬菇菌種質(zhì)量評價(jià)方法的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：1-61.

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書訊

《食用菌營養(yǎng)與烹飪》由湖南省食用菌研究所與中國食用菌協(xié)會、中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所共同編寫，主要包括毒菌類的識別方法、食用菌的選購與貯藏、食用菌的營養(yǎng)與保健作用、食用菌經(jīng)典菜式等內(nèi)容，重點(diǎn)介紹39種常見食用菌141個(gè)菜品的烹飪方法。烹飪方法結(jié)合了多地菜肴的特色，兼顧營養(yǎng)、口味、地域及燒、蒸、煮等各種制作技巧的使用，菜式豐富、搭配合理。內(nèi)容詳實(shí)、圖片精美，實(shí)用性強(qiáng)。

本編輯部現(xiàn)有少量存書，欲購者可直接匯款至中國食用菌雜志編輯部，本書定價(jià)29.8元，平郵加郵寄費(fèi)5元，掛號加郵寄費(fèi)10元，聯(lián)系電話0871-65151099。

《中國食用菌》編輯部

Comparison of the Colony Diameter Diffusion Method and Dry Weight Method in Optimizing the Culture Condition of Hypsizygus marmoreus Strain

SUN Lei,CHENG Xian-hao,LI Wei-huan,OU Sheng-ping,YANG Tao
(College of Agricultural,College of Life Science,Ludong University,Yantai 264025,China)

To optimize the culture medium and culture condition of Hypsizygus marmoreus strain,the colony diameter diffusion method and dry weight method were compared.There was a great difference between these two methods.The colony diameter diffusion method can not truly reflect the biomass of mycelium.

Hypsizigus marmoreus;the colony diameter diffusion method;dry weight method;biomass

S646.9

A

1003-8310（2015）03-0028-05

10.13629/j.cnki.53－1054.2015.03.008

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SDAIT－11－011－11）。

孫磊（1989－），男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)榫锷鷳B(tài)學(xué)。E－mail:734692973@qq.com

**通信作者：程顯好（1966－），男，博士，教授，主要從事菌物生態(tài)學(xué)和食藥用真菌產(chǎn)品研發(fā)研究。E－mail:chengxianhao@sohu.com

2015－03－15