杏鮑菇多孢分離菌株ISSR、RAPD分子標(biāo)記及體細(xì)胞不親和性分析

王小艷，王春暉，姜性堅(jiān)，陸 歡，徐 寧，胡如曉，李新菊

（湖南省食用菌研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

杏鮑菇多孢分離菌株ISSR、RAPD分子標(biāo)記及體細(xì)胞不親和性分析

王小艷，王春暉，姜性堅(jiān)，陸 歡，徐 寧，胡如曉，李新菊

（湖南省食用菌研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

通過(guò)杏鮑菇多孢分離菌株的ISSR、RAPD分子標(biāo)記和體細(xì)胞不親和性分析，體細(xì)胞不親和性分析得出子代杏1、杏3、杏4與出發(fā)菌株湘杏98有拮抗線，杏1、杏2、杏3、杏4四株子代均有明顯的拮抗線。16條ISSR引物和19條RAPD引物分別擴(kuò)增出99、154個(gè)條帶，多態(tài)性條帶分別占48.48%、61.00%；相似系數(shù)變異范圍分別為0.63～0.86、0.57～0.83。湘杏98、杏2、杏3在2種標(biāo)記的聚類(lèi)結(jié)果上存在差異。體細(xì)胞不親和性分析從表型上（拮抗線有無(wú)）反應(yīng)了菌株的遺傳變異。RAPD標(biāo)記遺傳相似系數(shù)小于ISSR標(biāo)記，表明ISSR標(biāo)記更適合親緣關(guān)系較近的種群間遺傳多樣性分析。

杏鮑菇；ISSR；RAPD

體細(xì)胞不親和性分析—拮抗反應(yīng)，該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)效果直觀明了，為食用菌異宗結(jié)合種類(lèi)遺傳特異性鑒定最常用的方法。RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）和ISSR（簡(jiǎn)單序列重復(fù)間）分子標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單、模板需求量少、引物容易得到和不需要知道被檢基因組序列等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于杏鮑菇品種間親緣關(guān)系及親本與雜交菌株遺傳多樣性檢測(cè)。馮偉林等[1]應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記分析杏鮑菇菌株遺傳差異，得到杏鮑菇生產(chǎn)菌株間的ISSR標(biāo)記指紋圖譜，構(gòu)建受試菌株間的遺傳親緣關(guān)系模型。劉曉紅[2]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)輔助杏鮑菇常規(guī)雜交育種，ISSR被用于杏鮑菇育種材料親緣關(guān)系鑒定及雜交后代與親本遺傳多樣性檢測(cè)。尚曉冬等[3]對(duì)從國(guó)內(nèi)外收集到的19株杏鮑菇菌株進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）分析，結(jié)果表明RAPD分析所得的遺傳相似性結(jié)果和體細(xì)胞不親和性分析，栽培所得的子實(shí)體形態(tài)結(jié)構(gòu)均比較接近。

本文采用體細(xì)胞不親和性分析，ISSR、RAPD分子標(biāo)記技術(shù)分析分別對(duì)供試材料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)分析與驗(yàn)證菌株的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，為杏鮑菇新品種選育種質(zhì)資源的鑒定提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。同時(shí)，通過(guò)對(duì)供試材料的體細(xì)胞不親和性與分子標(biāo)記及分子標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行比較，篩選一種適合親緣關(guān)系較近品種內(nèi)分子檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株親本為湖南省春華生物科技有限公司杏鮑菇工廠生產(chǎn)菌株湘杏98，由湖南省食用菌菌種保藏中心提供，杏1、杏2、杏3、杏4菌株為湘杏98多孢分離子代。

1.2杏鮑菇不同菌株體細(xì)胞不親和性試驗(yàn)

先將試驗(yàn)菌株活化，每個(gè)菌株在培養(yǎng)皿上接種2個(gè)點(diǎn)，放入恒溫培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中觀察拮抗反應(yīng)情況。

1.3菌絲體培養(yǎng)及DNA的提取

將活化后的供試菌株接入PDA液體培養(yǎng)基，置于搖床中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1，培養(yǎng)溫度25℃，10 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)好的供試菌絲體用無(wú)菌水清洗菌絲2次，用無(wú)菌濾紙吸干菌絲體上水分，菌絲采用400目銅網(wǎng)收集，-70℃保存?zhèn)溆谩NA提取采用CTAB法[4]，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4隨機(jī)引物篩選及其反應(yīng)體系

ISSR隨機(jī)引物篩選及其反應(yīng)體系參照馮偉林等[1]使用方法：在60個(gè)ISSR隨機(jī)引物中篩選出16個(gè)條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物用于ISSR-PCR擴(kuò)增。

RAPD隨機(jī)引物篩選及其反應(yīng)體系參照陳學(xué)軍等[5]使用方法：從60個(gè)引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性高的引物19個(gè)進(jìn)行RAPD分析。

1.5PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)

PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離1.5 h，電壓為10 V·cm-1，0.5 μg·L-1的溴化乙錠染色，待溴酚蘭距凝膠前緣1 cm左右停止電泳，Olympus C-740數(shù)碼相機(jī)拍照，反應(yīng)產(chǎn)物以Gene RulerTMDNA LadderMix為DNA Marker，估測(cè)分子量大小。

1.6數(shù)據(jù)分析

根據(jù)某一條譜帶在樣品中的出現(xiàn)和不出現(xiàn)分別賦值為1和0，統(tǒng)計(jì)各菌株的擴(kuò)增條帶數(shù)，用NTSYSpc2.1專(zhuān)業(yè)版軟件計(jì)算遺傳相關(guān)系數(shù)，采用平均連鎖法UPGMA進(jìn)行聚類(lèi)分析，得出聚類(lèi)圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1供試菌株菌絲間的拮抗試驗(yàn)

供試菌株親本與孢子自交子代菌株間的拮抗關(guān)系見(jiàn)圖1。

圖1 親本與子代拮抗線Fig.1 Parents and offspring antagonistic line

從圖1可知，親本湘杏98與其孢子自交子代杏2拮抗反應(yīng)不明顯，表明自交子代杏2與親本二者親緣關(guān)系較近。杏1、杏3、杏4與親本間均存在明顯拮抗線，表明3個(gè)自交子代與親本間存在不同的遺傳特性。自交子代菌株間拮抗結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 間拮抗線Fig.2 Tagonism between progeny lines

從圖2可知，自交子代間都存在明顯的拮抗線，表明子代菌株間的遺傳特異性。

2.2不同菌株間ISSR分析

16條引物的ISSR電泳圖譜見(jiàn)圖3。

對(duì)60條ISSR引物進(jìn)行了篩選，其中有16條引物（811、812、816、823、825、826、827、834、835、836、840、866、868、873、876、880） 能擴(kuò)增出條帶清晰且具多態(tài)性的帶譜，共計(jì)擴(kuò)增出99條清晰易辨的多態(tài)性DNA片段條帶，其中48條為多態(tài)性帶，多態(tài)性百分比為48.48%。結(jié)果顯示5個(gè)杏鮑菇菌株的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.63～0.86，遺傳差異變化較大，見(jiàn)表1。

圖3 不同引物擴(kuò)增圖譜Fig.3 Different primer Fingerprints

表1 供試菌株基因間ISSR相似性系數(shù)矩陣Tab.1 Genetic identity of strainswith ISSR method

從表1可以看出，親本湘杏98與孢子分離子代杏1遺傳差異最大，相似系數(shù)為0.70，杏4次之，相似系數(shù)為0.72，與杏2、杏3遺傳差異稍小些，相似系數(shù)分別為0.84、0.86。孢子分離子代間遺傳差異顯著，杏1與杏3遺傳差異最大，相似系數(shù)僅為0.63，杏3與杏4次之，相似系數(shù)為0.67，杏1與杏2相似系數(shù)為0.69，杏2與杏3遺傳差異相對(duì)較小，相似系數(shù)最高為0.85。

將5個(gè)杏鮑菇菌株的遺傳相似系數(shù)，采用平均連鎖法UPGMA進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建出5個(gè)杏鮑菇菌株的遺傳親緣系數(shù)樹(shù)狀圖，見(jiàn)圖4。

圖4 5個(gè)供試菌株的ISSR聚類(lèi)分析圖Fig.4 Cluster analysis of 5 accessions strains with ISSR method

從圖4可以看出，供試5個(gè)杏鮑菇菌株在相似系數(shù)為0.69時(shí)聚在一起，相似系數(shù)為0.76時(shí)聚為3個(gè)群。其中，親本湘杏98與子代杏2、杏3菌株聚為類(lèi)群Ⅰ，其中親本湘杏98與子代杏3親緣關(guān)系最近，子代杏1菌株單獨(dú)聚為類(lèi)群Ⅱ，子代杏4菌株單獨(dú)聚為類(lèi)群Ⅲ。

2.3不同菌株間RAPD分析

不同引物的擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖5。

圖5 不同引物擴(kuò)增圖譜Fig.5 Different primer fingerprints

對(duì)60條RAPD引物進(jìn)行篩選，其中有19條引物（S22、S24、S27、S28、S36、S39、S43、S64、S75、S78、S79、S126、S159、S242、S370、S484、S485、S2056、S2059） 能擴(kuò)增出條帶清晰且具多態(tài)性的帶譜，共擴(kuò)增出154條清晰易辨的多態(tài)性DNA片段條帶，94條為多態(tài)性帶，多態(tài)性百分比61.0%。

5株杏鮑菇菌株的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.57～0.83，遺傳差異變化較大，見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，親本湘杏98與孢子分離子代杏4遺傳差異最大，相似系數(shù)為0.57，杏1次之，相似系數(shù)為0.64，與杏2、杏3遺傳差異稍小些，相似系數(shù)分別為0.70、0.72。孢子分離子代間遺傳差異顯著，杏2與杏4遺傳差異最大，相似系數(shù)僅為0.62，杏2與杏4次之，相似系數(shù)為0.66，杏2與杏3遺傳差異相對(duì)較小，相似系數(shù)最高為0.83，杏1與杏2、杏3、杏4的相似系數(shù)相差不大分別為0.72、0.72、0.76。

應(yīng)用UPGMA聚類(lèi)法，構(gòu)建出5個(gè)杏鮑菇菌株的遺傳親緣系數(shù)樹(shù)狀圖，見(jiàn)圖6。

表2 供試菌株基因間RAPD相似性系數(shù)矩陣Tab.2 Genetic identity of strainswith RAPD method

圖65 個(gè)供試菌株的RAPD聚類(lèi)分析圖Fig.6 Cluster analysis of 5 accessions strains with RAPD method

從圖6可以看出，供試5個(gè)杏鮑菇菌株在相似系數(shù)為0.66時(shí)聚在一起，相似系數(shù)為0.70時(shí)聚為2個(gè)群，其中親本湘杏98與子代杏2、杏3菌株聚為類(lèi)群Ⅰ，子代杏1、杏4菌株聚為類(lèi)群Ⅱ。相似系數(shù)為0.78時(shí)聚為4個(gè)群，湘杏98聚為類(lèi)群Ⅰ，杏2、杏3菌株聚為類(lèi)群Ⅱ，杏1菌株單獨(dú)聚為類(lèi)群Ⅲ，杏4菌株單獨(dú)聚為類(lèi)群Ⅳ。

3 討論

菌絲之間的拮抗反應(yīng)是菌株間不同遺傳特性的重要表現(xiàn)，不同的種、種內(nèi)不同的菌株之間，接種在同一平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，會(huì)形成拮抗線。多孢分離部分子代與親本存在拮抗線，表明多孢分離可以獲得遺傳變異株。ISSR結(jié)果顯示，親本與多孢挑選子代相似系數(shù)為0.70～0.86，相似系數(shù)低于馮偉林[1]

從不同產(chǎn)區(qū)收集到品種ISSR分子標(biāo)記分析遺傳相似系數(shù)變異范圍（0.68～0.99）。PAPD結(jié)果顯示親本與多孢挑選子代相似系數(shù)為0.57～0.72，與尚曉冬[3]從國(guó)內(nèi)外收集到的供試的19株杏鮑菇菌株間RAPD圖譜相似系數(shù)（0.448～0.857）結(jié)果一致。試驗(yàn)結(jié)果表明，拮抗線反應(yīng)出多孢分離菌株在遺傳上發(fā)生了變異，ISSR與PAPD標(biāo)記量化了遺傳差異的程度，證明杏鮑菇多孢分離從遺傳變異角度作為新品種選育是可行的，但尚不能說(shuō)明多孢子代為選育的優(yōu)良菌株，還有待進(jìn)一步進(jìn)行多孢分離菌株產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等特性出菇試驗(yàn)檢測(cè)。

供試子代杏2與親本間無(wú)拮抗線，但I(xiàn)SSR與PAPD標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果均顯示杏2與親本間存在差異，與親本相似系數(shù)分別為0.848、0.707，為不同的遺傳菌株，結(jié)果表明拮抗線能從表型上反應(yīng)出部分遺傳差異遠(yuǎn)菌株間的遺傳差異，但不能反應(yīng)遺傳差異較小菌株間的遺傳差異，對(duì)于遺傳差異較小的菌株需采用分子標(biāo)記方法檢測(cè)。

比較ISSR、PARD技術(shù)對(duì)供試菌株的檢測(cè)結(jié)果，兩種標(biāo)記的多態(tài)性和檢測(cè)水平各不相同。RAPD標(biāo)記應(yīng)用于杏鮑菇親本與子代、子代與子代親緣關(guān)系檢測(cè)的平均多態(tài)性條帶數(shù)和比率均高于ISSR標(biāo)記，相似系數(shù)小于ISSR標(biāo)記。說(shuō)明RAPD標(biāo)記和ISSR標(biāo)記均可用于杏鮑菇種質(zhì)遺傳多樣性的檢測(cè)，但I(xiàn)SSR標(biāo)記比RAPD標(biāo)記可檢測(cè)遺傳多樣性的能力更高，更適于親緣關(guān)系較近的種群間遺傳多樣性分析。

[1]馮偉林，蔡為明，金群力.ISSR分子標(biāo)記分析杏鮑菇菌株遺傳差異研究[J].中國(guó)食用菌，2009，28（1）：47-49.

[2]劉曉紅，蔡為明，葉愛(ài)華，等.杏鮑菇種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（32）：78-79.

[3]尚曉冬，宋春艷，譚琦，等.杏鮑菇菌株RAPD指紋圖譜分析[J].食用菌學(xué)報(bào)，2009，16（3）：1-4.

[4]宿紅艷，王磊，劉林德.RF-RAPD分子標(biāo)記在杏鮑菇菌株鑒定上的應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2008，29（3）：264.

[5]陳學(xué)軍，程志芳，陳勁楓，等.辣椒種質(zhì)遺傳多樣性的RAPD和ISSR及其表型數(shù)據(jù)分析[J].西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（4）：662-670.

Analysis on Multi-spore Isolated Pleurotus eryngii Using ISSR and RAPD Molecular Markers and Somatic Incompability

WANG Xiao-yan,WANG Chun-hui,JIANGg Xing-jian,LU Huan,XU Ning,HU Ru-xiao,LI Xin-ju
(Hunan Provincial Institute of Edible Fungus,Changsha 410013,China)

ISSR,RAPD molecular marker and somatic incompatibility were used to analyze the multi－spore isolated Pleurotus eryngii.The result of somatic incompatibility showed that xing1,xing3,xing4 and parents xiangxing98 had antagonistic barrage, the barrage formation were apparently among xing1,xing2,xing3,xing4.16 ISSR primers and 19 RAPD primers combinations amplified 99,154 bands,respectively,polymorphic bands accounted for 48.48%,61.00%,the genetic similarity coefficient was 0.63～0.86,0.57～0.83,respectively.The clustering results of Xiangxing98,xing2,xing3 was different between the two clustering analysis.Analysis of somatic incompatibility reflected the genetic variation of strains on the phenotype (barrage had or not). The result of genetic similarity coefficient based on RAPD was lower than those based on ISSR.The results were indicated that ISSR marker was more suitable for analysis genetic diversity of close genetic relationship population.

Pleurotus eryngii;ISSR;RAPD

A

1003-8310（2015）03-0057-05

10.13629/j.cnki.53－1054.2015.03.014

王小艷（1980－），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌菌種保藏、品種選育方面研究。E－mail:wangxiaoyan1206@sohu.com

2015－02－16