ELISA鑒別條件下的野生羊肚菌菌種分離方法*

肖江勇，何秀霞，王 丹，劉 歡，劉春洋，王一東

（長春理工大學生命科學技術學院，吉林 長春 130022）

〈育種與馴化〉

ELISA鑒別條件下的野生羊肚菌菌種分離方法*

肖江勇，何秀霞，王 丹，劉 歡，劉春洋，王一東**

（長春理工大學生命科學技術學院，吉林 長春 130022）

為了提高分離的羊肚菌菌種的可靠性，在傳統菌種分離的基礎上，增加了酶聯免疫吸附試驗（ELISA）鑒別檢驗。對采自于吉林省吉林市的野生羊肚菌發生地的羊肚菌土壤基質及子實體分別進行了菌種分離，對分離得到的3株疑似羊肚菌的菌株進行了間接酶聯免疫吸附法（間接ELISA）免疫學方法檢測，確定其中的2株純培養菌絲為羊肚菌菌種。

羊肚菌；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）；菌種分離

羊肚菌（Morchella）是世界知名的食用菌，屬于子囊菌亞門 （Ascomycotina）、盤菌綱 （Discomycetes）、盤菌目 （Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella），因其味美、稀缺、具有保健價值而受到人們的重視，具有巨大的市場價值和商業前景[1－2]。由于羊肚菌出菇所需要條件很難掌握，目前還難于實現完全人工栽培[3－8]。影響羊肚菌人工栽培的諸多因素中，羊肚菌菌種的分離與采用是關鍵因素之一。有效、準確地分離菌種對實現羊肚菌的人工栽培意義重大[9]。由于出菇周期較長，不易出菇，且缺少形態學鑒別手段，這給羊肚菌菌種的鑒定造成了一定困難。目前有研究報道對羊肚菌ITS區測序來鑒定羊肚菌菌絲的方法[10－11]，這樣的檢測技術雖然精確，但操作手續繁瑣，對設備要求高，不便于廣大羊肚菌研究者及菇農使用，本研究所采用的ELISA免疫學鑒定方法[12－14]，可彌補這一不足。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 標準菌株、羊肚菌子實體及土壤樣本

羊肚菌（Morehella esculenta）菌株（51589號），購于中國農業微生物菌種保藏中心。

毛柄金錢菌（Flammulina velutiper）菌種、黑木耳（Auricularia auricula） 菌種，購于吉林農業大學菌物研究所。

野生羊肚菌子實體及其發生地土壤樣本，2012年5月采自于吉林市松花湖地區，現保存于本實驗室。

1.1.2 主要試劑

HRP標記山羊抗鼠IgG（H+I），購于北京中杉金橋生物技術有限責任公司；TMB，Sigma公司產品；培養基，用于普通真菌菌絲培養的馬鈴薯培養基（PDA）；抗羊肚菌單克隆抗體（W8C9株腹水），長春理工大學生命科學技術學院制備并保存于該實驗室[15]。

1.1.3 主要儀器與設備

HZQ-QX型恒溫振蕩培養箱、MDF-192型低溫冰箱，SANYO公司；ELx800TM酶標儀，美國伯騰儀器有限公司，等。

1.2方法

1.2.1 標準羊肚菌菌絲的培養及標準抗原的制備

將51589號羊肚菌菌種在無菌條件下轉接到PDA液體培養基中培養，轉速110 r·min-1、溫度23.5℃。3 d后在無菌條件下挑取少量培養液轉接至PDA固體平皿中進行培養，觀察菌落形態，鏡下觀察菌絲形態。

對上述PDA液體培養基培養獲得的菌絲球進行離心收集，將收集的菌絲放入研缽中，加適量的滅菌海砂及pH7.4的磷酸鹽緩沖液（以下簡稱PBS），進行充分研磨破碎，收集研磨后液體進行離心，5 000 r·min-1離心5 min，離心上清液即為羊肚菌抗原原液。用同樣的方法制備金針菇及木耳抗原液。

1.2.2 ELISA間接法檢測羊肚菌抗原方法的建立

包被：將羊肚菌抗原原液用0.05 mol·L-1pH9.6的碳酸鹽包被緩沖液進行適量稀釋，在酶標板每孔中加入0.1 mL，4℃包被過夜，棄去孔內溶液，用含有吐溫20的PBS（以下簡稱PBS-T）洗滌緩沖液浸泡、沖洗3次，3 min·次-1。同時做金針菇、木耳及空白包被對照。

將抗羊肚菌單克隆抗體W8C9使用PBS進行適量稀釋（一抗），于上述已包被的反應孔中每孔加0.1 mL，置于37℃溫育1 h，PBS-T洗滌4次，3 min·次-1。

將HRP標記的山羊抗鼠IgG用PBS稀釋3 000倍（二抗），于每個反應孔中加入0.1 mL，37℃溫育50 min，PBS-T洗滌4次，3 min·次-1。

在各反應孔中加入現配的底物TMB顯色液0.1 mL，室溫下避光反應10 min。

終止反應，在各個孔中加入0.05 mL 2 mol·L-1的硫酸。

結果檢測，利用酶標儀檢測450 nm波長處OD值。

1.2.3 野生羊肚菌菌種分離

（1）土壤基質菌種分離法

將土壤基質樣本用無菌生理鹽水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度，稀釋成土壤樣本懸液，無菌條件下用無菌移液器分別由上述稀釋液中各吸取0.1 mL，加入到已標記好稀釋度的固體PDA平皿中進行涂布；挑取10-1的土壤懸液，直接在平皿上進行劃線分離，室溫下避光進行培養，觀察。

（2）子實體孢子分離法

用新鮮羊肚菌子實體，在無菌條件下收集羊肚菌孢子，將收集的孢子制成孢子懸液并鏡檢，并用無菌移液器吸取孢子液0.1 mL加入到平皿培養基中進行涂布，室溫下避光培養，觀察。

（3）分離疑似羊肚菌菌落

無菌挑取上述平皿上疑似羊肚菌的白色菌落進行顯微檢查，將疑似羊肚菌的菌落做好標記后，分離培養并接種至PDA液體培養基中進行培養，收集培養物，參照標準抗原的處理方法，按標號制備成待檢抗原。

1.2.4 ELISA間接法檢測分離菌株

按方法1.2.2，將待檢抗原替代標準羊肚菌抗原進行包被，其他步驟相同。檢測待檢樣品的OD值，以P/N比（樣本與陰性對照的OD值比值）≥2.1為陽性，＜2.1為陰性。

1.2.5 菌種的擴大培養與保存

將經過常規菌種分離得到的疑似羊肚菌菌種，經ELISA檢測，結果為陽性的菌株確定為分離得到的羊肚菌菌種。按編號接種至試管斜面培養基培養，待菌絲長出后，作為分離得到的羊肚菌菌種，轉到4℃進行保存。

2 結果與分析

2.1標準羊肚菌菌絲形態

PDA液體培養基培養3 d開始形成菌絲球，初期為乳白色，此時培養液較為澄清，其菌絲在顯微鏡下為絲狀體形態，具有隔膜，分枝較多，胞內的細胞器清晰可見。隨著培養時間的加長，菌絲球逐漸增大，顏色變暗。

PDA固體平皿培養3 d開始出現白色菌落，7 d后菌絲長滿。顯微鏡下可見氣生菌絲相對營養菌絲較細，隔膜不明顯，胞內細胞器亦清晰可見。

2.2ELISA間接法檢測標準羊肚菌抗原方法的建立

采用ELISA間接法分別對標準羊肚菌抗原、木耳及金針菇進行檢測，以P/N比≥2.1判定為陽性，結果見表1。

表1 ELISA間接法檢測標準羊肚菌抗原結果Tab.1 The results of morel antigen detection by indirect ELISA

由表1可以看出，標準羊肚菌抗原經ELISA間接法檢測后，顯示出相對較高的陽性（以P/N＞2.1為陽性），金針菇、木耳經過同濃度包被，其OD值與陰性對照相比（P/N比）的值遠小于2.1，可見單抗W8C9與木耳、金針菇等食用菌之間沒有交叉反應。經過多次檢測，結果均表現較好的重復性。

2.3菌種分離結果

參照羊肚菌平皿菌落及菌絲顯微形態，分離得到3個疑似羊肚菌菌絲的菌株，分別編號T-01、T-02、B-01。按照標準羊肚菌抗原的處理方法，處理得到3個對應編號的待檢抗原，4℃保存。

2.4ELISA間接法鑒定分離菌株

采用ELISA間接法對分離的菌株進行檢測，以P/N比≥2.1判定為陽性，檢測結果見表2。

由表2可見，以標準羊肚菌抗原為陽性對照，抗原空白包被為陰性對照進行了ELISA間接法檢測，檢測結果顯示T-01、B-01為陽性，T-02、金針菇、木耳為陰性（以P/N＞2.1為陽性）。經過多次檢測，結果均表現出較好的重復性，確定T-01、B-01為羊肚菌菌絲。對分離得到的T-01、B-01羊肚菌菌株進行菌種擴大，保存。

表2 ELISA間接法檢測分離菌株檢測結果Tab.2 The results of isolated stains detection by indirect ELISA

3 討論

與傳統的擔子菌食用菌菌種分離不同，由于羊肚菌還不能實現完全人工栽培，不易通過栽培出菇的形態學方法對分離的菌種進行鑒定，因此對其菌種的分離鑒定就顯得尤為困難。本研究對野生羊肚菌樣本材料進行常規菌種分離，對分離得到的疑似菌株進行免疫學方法檢測，排除了無羊肚菌特異性抗原的疑似菌株，確定了2株含有羊肚菌特異性抗原的純培養物為羊肚菌菌種。

本研究所用的W8C9株單克隆抗體，是以51589號羊肚菌菌種為抗原，經細胞融合篩選得到的單克隆雜交瘤細胞株制得，對該單克隆抗體進行多次該單抗與其他羊肚菌標準菌株（51536#、51537#）及近10種常見食用菌菌絲抗原交叉試驗，檢測結果表明該單抗對標準羊肚菌菌絲及采集的羊肚菌子實體樣本表現出良好的特異性結合、與其他食用菌不結合。本實驗中表1即為特異性檢驗的結果。

與常規檢測抗原的雙抗體夾心ELISA法相比，間接ELISA法在檢測少量抗原樣本時具有方法簡單、影響因素少、成本低、快速的特點，故本研究采用間接ELISA法進行羊肚菌菌絲的鑒別檢測。

本研究方法的建立，為羊肚菌菌種的快速鑒別提供了一個可行的參考方法，同時也為更加便捷快速的羊肚菌金標檢測試紙條、ELISA快速定量檢測試劑盒等免疫學方法的建立提供實驗參考。

實驗中發現從羊肚菌子實體孢子分離得到的羊肚菌菌絲，在固體培養基培養初期菌絲為白色，隨著培養時間的延長，其菌絲連同培養基顏色轉變為褐色，與有關研究報道相符；但購買的標準羊肚菌菌絲和羊肚菌基質土壤分離得到的菌絲，在固體培養基上培養始終呈現為白色，引起這種差別的原因，有待進一步探討。

在實驗中還發現，無論是標準羊肚菌菌種還是經分離鑒定為羊肚菌的菌種，其在液體培養基中培養及處理得到的抗原過程中，均散發著一股獨特的清香氣味，這可能與羊肚菌分泌的揮發性氨基酸有關。這種現象可否作為實際工作中羊肚菌菌絲的快速鑒定指標之一還有待驗證。

[1]朱林，程顯好，田吉騰.羊肚菌的研究進展[J].安徽農業科學，2008，36（10）：4054-4057.

[2]謝占玲，謝占青.羊肚菌研究綜述[J].青海大學學報：自然科學版，2007，25（2）：36-40.

[3]朱斗錫.羊肚菌人工栽培研究進展[J].中國食用菌，2008，27（4）：3-5.

[4]李華，包海鷹，李玉.羊肚菌研究進展[J].菌物研究，2004，2（4）：53-60.

[5]Brock TD.Studies on culture of Morchella[J].Mycologia，1951（43）：402-422.

[6]馬向東.食用菌栽培新技術[M].開封：河南大學出版社，2002：270.

[7]Ower R.Notes on the development of the morel aseoea RP：Morchella esculenta[J].Myeologia,1982,74(1):35-38.

[8]戴玉淑，徐方杰，趙艷春.羊肚菌的栽培技術[J].中國農村小康科技，2008（3）：40-41.

[9]王廣耀，蔣曉成，程喆.羊肚菌菌種分離及母種培養基的篩選[J].食用菌，2009（9）：211-214.

[10]沈洪，陳明杰，趙永昌，等.云南羊肚菌rDNA的ITS序列與親緣關系分析[J].食用菌學報，2007，14（2）：15-18.

[11]Daniel Wipe,JC Munch,B Botton,etc.DNA polymorphism in morels:complete sequences of the internal transcribed spacer of genes coding for rRNA in Morchella esculenta (Yellow Morel) and Morchella conica (Black Morel)[J]. Applied And Environmental Microbiology,1996:3541-3543.

[12]田雪，劉建，孫樺男，等.以羊肚菌茵絲為抗原的不同免疫程序對Balb/c鼠抗體水平的影響[J].長春理工大學學報：自然科學版，2012，35（1）：156-160.

[13]于秋麗，趙曉娥，胡林勇，等.間接EILSA法檢測羊促乳素抗體方法的建立[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2009，37（2）：48-50．

[14]馬帥，陳華林，王雅文，等.免疫酶染色法對羊肚菌菌絲特異性靶位的初步定位與分析[J].菌物研究，2014，12（6）：115-118.

[15]王一東，劉建.一株抗羊肚菌單克隆抗體及其制備方法：中國，200910218152.8[P].2010-06-09.

云南：昆明食用菌研究所努力促進產業升級轉型

據悉，昆明食用菌研究所多舉措服務于特色食用菌產業的“最后一公里”，為云南高原特色食用菌產業升級轉型發展夯實了基礎。

據了解，該研究所先后構建完善食用菌技術支撐研發平臺4個，改造建設食用菌資源庫、優良菌種選育、精深加工和新產品開發、檢驗檢測服務等實驗室400多平方米，配套購置儀器19件（臺）。并建立4個首席科學家牽頭的技術服務團隊，設立5個專家工作站和技術服務組，選派5組10個科技特派員，開展包括人工栽培食用菌、食用菌精深加工、羊肚菌原生境擴繁促產、野生食用菌保護利用、人工食用菌高產優質栽培5個方面的技術指導、培訓及技術服務。

同時，該研究所還建設了培育食用菌良種繁育及新品種（菌種）栽培、食用菌標準化栽培、食用菌精深加工等3個示范基地，在昆明雙龍、馬龍等地改造大棚33 000多平方米；在昆明雙龍、永勝、馬龍、保山施甸等地建立香菇、平菇、木耳、金針菇、雙孢菇等栽培示范基地15個，示范面積60多萬平方米，生產優質菇逾2 200 t；在野生食用菌主產區，建立松茸、羊肚菌、牛肝菌、大紅菇等野生食用菌保護培育及擴繁基地13個，面積超過8 400畝。

此外，該研究所還篩選了食用菌良種19個：黑木耳良種3個、香菇良種7個、茶樹菇良種6個、平菇良種1個、金針菇良種1個、金耳優良菌種1個；建立了食用菌良種繁育生產線1條，年產300萬瓶（袋）以上，完成優良菌種制種200萬瓶（袋），示范良種配套栽培20萬平方米。同時，還開展了食用菌精深加工研發示范，研發產品42個，共計生產5 050 t。研究所還制（修）食用菌菌種生產技術規程5項，食用菌標準化生產技術規程6個，企業標準3項，通過標準的實施服務菇農2 0000多人次。

中國食用菌信息網

2015.04.30

The Methods of Vegetative Mycelium Isolated from Wild Morchella under the Identification of ELISA

XIAO Jiang-yong,HE Xiu-xia,WANG Dan,LIU Huan,LIU Chun-yang,WANG Yi-dong
（Changchun University of Science and Technology,School of Life Science and Technology,Changchun 130022,China）

In order to improve the dependance of strains isolation from the Morchella,the ELISA was added to identification on the basis of traditional strains separation.Isolating strains from fruit body and the soil collected from Jilin.Three strains that were similar to Morchella hyphae have been got.The uncertain isolated strains were detected by the way of ELISA.Two of them were proved to be Morchella.

Morel;Enzyme－linked immunosorbent(ELISA);strains isolation

S646.9

A

1003-8310（2015）03-0011-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2015.03.003

長春理工大學“大學生創新創業訓練計劃項目”（2012S46、2013x108）。

肖江勇（1990－），男，本科，研發工程師，主要從事珍稀食藥用真菌栽培研究。E－mail:XJY_job5983@163.com

**通信作者：王一東（1962－）男，本科，高級實驗師，主要從事食品與衛生檢驗研究。E－mail:wyd@cust.edu.cn

2015－03－10