一例豬偽狂犬病病毒的分離鑒定及綜合防治措施

楊 凡，徐志文，李 萍，方和俊，郭 博，周遠(yuǎn)成

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 動物生物技術(shù)中心，四川 成都 611134）

一例豬偽狂犬病病毒的分離鑒定及綜合防治措施

楊 凡，徐志文*，李 萍，方和俊，郭 博，周遠(yuǎn)成

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 動物生物技術(shù)中心，四川 成都 611134）

無菌采集疑似豬偽狂犬病病豬腦組織，進(jìn)行病毒的分離鑒定。經(jīng)PCR檢測為陽性的病料接種PK-15細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，將所分病毒暫命名為SC株。蝕斑實驗測定病毒滴度，并采用PCR和瓊擴(kuò)實驗對其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。結(jié)果：PRV陽性病料接種PK-15細(xì)胞，傳至第5代后產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、變亮、聚堆且可見典型的空斑，而對照組細(xì)胞貼壁生長良好；基于PRV gE基因的PCR檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物為378 bp，與預(yù)期目的條帶一致；用病毒蝕斑技術(shù)測定該分離株的滴度為2.65×104PFU/mL；瓊擴(kuò)實驗顯示病毒原液至32倍稀釋后均能與PRV陽性血清形成可見沉淀線。以上結(jié)果均表明所送檢病豬為PRV陽性，據(jù)此為豬場提出綜合防治措施。

豬偽狂犬病病毒；分離鑒定；蝕斑實驗；瓊擴(kuò)實驗；綜合防治

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（PRV）引起的多種家畜和野生動物共患的一種急性傳染病。病豬以新生仔豬的急性死亡，4周齡以上的仔豬出現(xiàn)嘔吐、神經(jīng)癥狀和妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及呼吸道癥狀為主要特征，可能引起人的輕微感染[1-3]。偽狂犬病的首次發(fā)現(xiàn)追溯到1813年的美國牛群中，隨后蔓延分布至全世界。1947年，我國首次報道PRV，目前該病已在國內(nèi)廣泛流行。本病尚無有效治療的藥物，只能靠接種疫苗預(yù)防，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。2015年3月，四川崇州某規(guī)模化豬場出現(xiàn)疑似偽狂犬病癥狀病豬，剖檢發(fā)現(xiàn)患病豬扁桃體、肝和脾均有散在的白色壞死點，腎臟有針尖大小出血點，且出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的病豬腦脊液增多。本研究擬采集發(fā)病豬腦組織，進(jìn)行基于PRV gE基因的PCR檢測，經(jīng)PCR檢測為陽性的病料接種PK-15細(xì)胞開展病毒分離，并將分離所得病毒株再次進(jìn)行PCR檢測，用蝕斑實驗測定該病毒株的滴度，采用瓊擴(kuò)實驗對該病毒進(jìn)一步鑒定[5-9]。最后，根據(jù)相應(yīng)診斷結(jié)果提出綜合防治措施。

1 材料和方法

1．1 實驗材料

1.1.1 病料采集

無菌采集崇州某豬場疑似PRV發(fā)病仔豬腦組織，經(jīng)研缽研磨后，加PBS配制1：5組織懸液，-20 ℃凍存。

1.1.2 實驗試劑

1 000單位雙抗；豬腎傳代細(xì)胞（PK-15）由實驗室保存；新生犢牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibco公司；營養(yǎng)液（含10% 犢牛血清）、維持液（含2% 犢牛血清）、無鈣鎂水；飽和酚、氯仿、異丙醇、25% 冰乙醇；PRV陽性血清、PCR試劑盒等。

1．2 實驗方法

1.2.1 總DNA提取

取出凍存的組織懸液，-20 ℃和37 ℃，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min 離心5 min；取400 μL上清液于無菌EP管中，加入500μL飽和酚，混勻，靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入酚、氯仿各200 μL，混勻，靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入酚、氯仿各200μL，混勻，靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入400μL氯仿，混勻，靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離 心5 min；取上清，加入2倍體積異丙醇，輕搖約2 min，室溫靜置15 min，4℃，12000r/min離心15 min；棄上清液，加入1 mL 25% 冰乙醇洗滌沉淀及管壁，4 ℃，12 000 r/min離心5 min；棄上清液，室溫干燥沉淀后加入35μL ddH2O溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r，提取正常細(xì)胞的DNA做陰性對照。

1.2.2 病料PCR檢測

根 據(jù)GenBank上 發(fā) 表 的PRV gE基因保守序列設(shè)計合成1對引物，上游引物：5’-TGCTCG TGATGACCCACAAA-3’；下游引物：5’-TGTACACCGGCGAGAGCAT -3’，預(yù)期目的片段大小為378 bp。引物序列送至寶生物工程（大連）有限公司合成。

以提取的病毒DNA和正常細(xì)胞DNA為模板，按照下列PCR體系（10μL體系）進(jìn)行擴(kuò)增（見表1）。

反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，總共35個循環(huán)；72 ℃總延伸7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄實驗結(jié)果。

表1 PCR擴(kuò)增體系

1.2.3 病毒分離

取出凍存的組織懸液，反復(fù)凍融3次，離心取上清， 每1 mL上清液加1 000單位雙抗，置4 ℃處理過夜。

觀察培養(yǎng)的PK-15細(xì)胞生長狀況，當(dāng)貼壁鋪滿單層，棄去培養(yǎng)液，無鈣鎂水洗2～3次，每瓶接種600μL處理好的組織懸液，對照組加入等量培養(yǎng)液。37 ℃吸附作用1 h，在此期間每隔15 min輕輕搖晃細(xì)胞瓶，使細(xì)胞和病毒液充分接觸。每瓶加入4 mL維持液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)70%以上時收毒，即-20 ℃和37 ℃反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心15 min，取上清。將收取的病毒液繼續(xù)接種PK-15單層細(xì)胞傳代培養(yǎng)，先盲傳3代，直至產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞病變，收毒，-70 ℃凍存。

1.2.4 病毒PCR檢測

按1．2．1步驟，用酚、氯仿法抽提第5代、第7代病毒液總DNA，進(jìn)行豬偽狂犬病病毒的PCR檢測。同時，應(yīng)用本實驗室建立的豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）RT-PCR檢測方法和豬細(xì)小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）PCR檢測方法，對第7代病毒液進(jìn)行外源性病毒檢測。

1.2.5 蝕斑實驗

將六孔培養(yǎng)板中各孔已長滿單層細(xì)胞的的營養(yǎng)液吸棄，并將第7代病毒液連續(xù)進(jìn)行10倍稀釋，選取10-2稀釋度，接種于六孔板各孔，每孔0．2 mL，輕輕搖動使病毒液均勻分布于細(xì)胞表面；置37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，吸附1 h后，加入1% 甲基纖維素培養(yǎng)基，使其均勻覆蓋于細(xì)胞表面；置37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～7 d；將覆蓋的甲基纖維素吸出棄之，用5%福爾馬林-1%結(jié)晶紫固定染色液固定和染色感染細(xì)胞，每孔加入1 mL；20 min后，用水沖洗，觀察細(xì)胞生長狀況，記錄蝕斑個數(shù)。

1.2.6 瓊擴(kuò)實驗

用PBS配制1%瓊脂液，倒于平板內(nèi)制成凝膠。取打孔器在瓊脂凝膠上打梅花孔，孔徑為2 mm，中央孔與周圍孔間距約3 mm。將病毒液作2倍倍比稀釋，即1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。中央孔滴加PRV陽性血清，周圍孔分別滴加稀釋后的病毒液。試驗設(shè)立對照組，中央孔滴加PRV陽性血清，周圍各孔均滴加等量的稀釋液。保持一定濕度，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱擴(kuò)散24 h，觀察記錄沉淀線情況。

2 實驗結(jié)果

2．1 病料PCR檢測

用組織懸液抽提得到的DNA為模板，進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增，設(shè)立PRV陰性和陽性對照，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA Marker DL 2 000為標(biāo)準(zhǔn)，病料模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小近似378 bp，擴(kuò)增出的特異性片段與預(yù)期的大小一致（圖1）。

2．2 病毒分離

圖1 病料PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 PRV分離株在PK-15細(xì)胞上的變化

經(jīng)處理的PCR檢測為陽性的送檢病豬病料，接種PK-15細(xì)胞，盲傳3代未見明顯細(xì)胞病變。傳至第4代，接毒后46 h可見部分細(xì)胞變圓、變亮、脫落形成典型的空斑，對照組無細(xì)胞變圓、脫落；病毒傳至第5代以后，感染后38 h均可見80%左右細(xì)胞產(chǎn)生病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、變亮、聚堆且細(xì)胞病變初可見典型的空斑，即在PK-15細(xì)胞上產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞病變，對照組細(xì)胞貼壁良好，無明顯細(xì)胞病變（圖2）。

2．3 病毒PCR檢測

用第5、第7代病毒液抽提得到的DNA為模板，進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增，設(shè)立PRV陰性和陽性對照，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA Marker DL2 000為標(biāo)準(zhǔn)，病毒液模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小近似378 bp，擴(kuò)增出的特異性片段與預(yù)期的大小一致，而外源性病 毒：CSFV、PRRSV、JEV、PPV、PCV2檢測均為陰性（圖3）。

2．4 蝕斑實驗

將收獲的第7代病毒液稀釋后，選擇10-2稀釋度接種PK-15細(xì)胞，接種后于37 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)5 d，觀察并記錄蝕斑個數(shù)，測得六孔板中平均每孔形成53個蝕斑，則病毒懸液的蝕斑形成單位為2．65 ×104PFU/mL，即每1 mL病毒液滴度為2．65×104PFU（圖4）。

圖3 病毒PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖4 蝕斑實驗結(jié)果

2．5 瓊擴(kuò)實驗

將病毒液作2倍倍比稀釋，實驗組中央孔滴加PRV陽性血清，周圍孔分別滴加稀釋后的病毒液。對照組中央孔滴加PRV陽性血清，周圍孔滴加等量的病毒稀釋液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：病毒原液至32倍稀釋均可見抗原抗體沉淀帶，從64倍稀釋度開始未見沉淀帶。對照組中均未見抗原抗體沉淀帶（見圖5）。

圖5 瓊擴(kuò)實驗結(jié)果圖

3 結(jié)果討論

目前，我們已掌握許多對豬偽狂犬病病毒進(jìn)行分離鑒定的方法，比如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、蝕斑實驗（plaque formation test）、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散實驗（agar gel immunodiffusion test，AGID）等。PCR技術(shù)又稱為體外基因擴(kuò)增技術(shù)，誕生于1985年。Belak等應(yīng)用gB基因引物率先建立了檢測PRV的PCR方法，檢測PRV與其他豬病毒病的多重PCR方法在近年也相繼建立。PCR具有敏感、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，還能活體檢測大批量樣品，目前在病毒鑒定上已經(jīng)得到廣泛運用[5，6]；AGID最早的應(yīng)用是在1905年為研究利澤甘氏現(xiàn)象，1932年應(yīng)用于細(xì)菌菌株的鑒定。Oudin于1946年在試管中進(jìn)行了瓊擴(kuò)實驗，對抗原混合物進(jìn)行分析。Elek和 Ouchterlony于1948年分別建立了瓊脂雙向雙擴(kuò)散法，可以同時鑒定、比較2種以上抗原或抗體，并對免疫擴(kuò)散的理論依據(jù)相繼進(jìn)行了研究。瓊擴(kuò)試驗操作簡單、快捷，較適用于現(xiàn)場定性診斷和豬群陰性無感染者的普查，但結(jié)果易受pH、溫度等影響[7]。

PRV廣泛分布于機(jī)體各組織臟器中，比如扁桃體、肝臟、脾臟、肺和腎臟，但感染量以腦部三叉神經(jīng)節(jié)居多，因此實驗中主要采集病豬腦組織進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)[10-11]。PRV具有泛嗜性，能在許多細(xì)胞中增殖，其中以ST細(xì)胞和PK-15細(xì)胞最敏感，在接種后24～72 h可出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，其次是BHK-21、MDBK、CEF等細(xì)胞。試驗中常用PK-15、BHK-21、MDBK等傳代細(xì)胞系分離培養(yǎng)該病毒[12]。

本實驗從病豬腦組織分離得到1株P(guān)RV，對該株病毒進(jìn)行PCR 檢測、蝕斑實驗、瓊擴(kuò)實驗后，證實該分離是成功的。針對以上實驗結(jié)果，對豬場建議主要包括以下幾個方面。第一，立即淘汰出現(xiàn)相應(yīng)臨床特征的豬群，尤其是仔豬和種豬，同時采用2%～3%氫氧化鈉或熟石灰對相應(yīng)圈舍地面、墻壁及周圍場地進(jìn)行嚴(yán)格消毒處理。第二，抽取豬場中所有豬只血樣，并標(biāo)記清楚。用PRV gE抗體檢測試劑盒進(jìn)行抗體檢測，淘汰檢測結(jié)果呈陽性的全部豬只，陰性豬只進(jìn)行嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)。對測定結(jié)果為可疑的豬只先實行隔離飼養(yǎng)，然后重新采血檢測，根據(jù)檢測結(jié)果作出相應(yīng)處理。第三，采集隔離飼養(yǎng)的所有健康豬群血樣，進(jìn)行PRV gB抗體檢測，對所有陰性豬只緊急接種弱毒疫苗。第四，完善飼養(yǎng)管理制度。嚴(yán)禁從PRV陽性豬場引種，對待引進(jìn)豬只采血檢測，確定為陰性后方可引進(jìn)，最好自繁自養(yǎng)。豬群盡量做到全進(jìn)全出。豬場實行封閉式管理，外來人員必須經(jīng)過相應(yīng)消毒措施處理，隔離3 d后才可進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)。圈舍和周圍場地平時嚴(yán)格消毒，做好清潔衛(wèi)生。針對不同生長階段的豬群，合理搭配日糧。第五，制定合理免疫程序。仔豬出生3日齡后進(jìn)行偽狂犬病疫苗滴鼻免疫，5～6周齡時肌肉注射1頭份，種公豬每半年普免1次，母豬產(chǎn)前3個月普免1次[13]。

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2015-09-02）

四川省科技成果轉(zhuǎn)化項目（2013NC0014）；四川省科技支撐計劃（2013NZ0016）

楊凡（1992-），男，四川南充人，在讀碩士研究生，主要研究方向為動物傳染病病原分子生物學(xué)。E-mail：abtcyf@126.com

徐志文，教授，博士，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：abtcxzw@126.com