β-興奮劑的常用檢測(cè)方法研究進(jìn)展

聶 婉，伍曉紅，陳秋玲，周 柳，王琤韡

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330013）

β-興奮劑的常用檢測(cè)方法研究進(jìn)展

聶 婉，伍曉紅，陳秋玲，周 柳，王琤韡*

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330013）

本文在簡要介紹了β-興奮劑檢測(cè)中樣品前處理技術(shù)的基礎(chǔ)上，總結(jié)了近幾年來國內(nèi)外檢測(cè)動(dòng)物性食品中β-興奮劑的常用分析方法，指出現(xiàn)行方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并提出了今后的發(fā)展趨勢(shì)。

β-興奮劑；常用檢測(cè)方法；研究進(jìn)展

β-興奮劑作為一種促腎上腺受體激動(dòng)劑，常被用于治療哮喘類呼吸道疾病。隨著美國首次將其投入飼料發(fā)現(xiàn)能提高瘦肉率后，被廣泛地應(yīng)用在畜牧業(yè)中，常見β-興奮劑的結(jié)構(gòu)式及類型如表1所示。在瘦肉精中毒事件的相繼出現(xiàn)后，β-興奮劑的不安全性逐漸顯現(xiàn)，諸多國家立法嚴(yán)厲禁止β-興奮劑在飼料和飲用水中的非法使用。本文簡要概述近幾年國內(nèi)外對(duì)β-興奮劑的樣品的前處理技術(shù)和常見檢測(cè)方法的研究進(jìn)展。

表1 常見的β-興奮劑

1 樣品的前處理

分析樣品的前處理過程，可細(xì)分為4大步驟（取樣 、提取、純化和濃縮），必要情況下還需要衍生化的處理。選取樣品時(shí)，可供選擇的樣品一般分為2大類：可食用組織（血液、內(nèi)臟、肌肉等）和不可食用組織（尿液、毛發(fā)、視網(wǎng)膜等）。可食用組織中獸藥殘留量大，但處理相對(duì)繁瑣，不可食用組織中則含量較低，采集相對(duì)容易。在樣品前處理的后續(xù)步驟中，經(jīng)典的液液萃取技術(shù)，由于易引入雜質(zhì)、成本相對(duì)較高等缺點(diǎn)，使用頻率相對(duì)較少；分子印跡技術(shù)、免疫親和色譜技術(shù)和超臨界萃取技術(shù)，雖具有高選擇性和強(qiáng)特異性等優(yōu)點(diǎn)，但耗時(shí)耗資的缺點(diǎn)需要進(jìn)一步完善；新興的樣品前處理方法中，由固相萃取發(fā)展來的基體分散固相萃取法，步驟更精簡、用量更少，趨向于標(biāo)準(zhǔn)化、一體化的分析模式。目前，微萃取技術(shù)與固相萃取技術(shù)憑借低成本、強(qiáng)選擇性和易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，在β-興奮劑檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛。

2 常見檢測(cè)方法研究進(jìn)展

2．1 免疫分析技術(shù)

2.1.1 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

酶聯(lián)免疫法基于競爭性酶反應(yīng)原理，根據(jù)顯示結(jié)果的顏色深度來分析待測(cè)物的含量，此方法常分為抗體的間接法、抗原的競爭法和抗原的雙抗體夾心法。此方法作為較為成熟的檢測(cè)方法，不需要昂貴的儀器設(shè)備，靈敏度高、特異性強(qiáng)且樣品前處理相對(duì)簡單，但因抗體理化性質(zhì)不穩(wěn)定，故具有較高的假陽性，且制備和純化過程相對(duì)復(fù)雜，現(xiàn)常被用作現(xiàn)場的大批量初篩。胡霏等（2013）對(duì)借助方陣滴定ELISA法的抗體制備過程進(jìn)行了優(yōu)化，最后制成的酶標(biāo)板反應(yīng)時(shí)間僅需15分鐘，極大提高了檢測(cè)效率。王俊平等（2011）借助混合酸酐法建立的沙丁胺醇直接酶聯(lián)免疫法，實(shí)際檢測(cè)過程中沙丁胺醇與結(jié)構(gòu)類似物幾乎沒有交叉反應(yīng)，檢測(cè)限也遠(yuǎn)低于國家殘留。出于對(duì)交叉反應(yīng)的考慮，在執(zhí)法過程中如使用鹽酸克倫特羅檢測(cè)卡后顯示為陽性，但在最后的氣相色譜-質(zhì)譜法確證又為陰性時(shí)，必須檢測(cè)沙丁胺醇的存在。

2.1.2 膠體金免疫層析法（GICA）

膠體金免疫層析法是將膠體金作為示蹤標(biāo)志物的新型免疫標(biāo)記技術(shù)，僅需肉眼觀察2條檢測(cè)限的顏色變化來判斷檢測(cè)結(jié)果，快速簡便且特異性強(qiáng)，多用于現(xiàn)場的快速檢測(cè)和大通量初篩。膠體金的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大影響，當(dāng)膠體金pH接近且不低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，表面的吸附量最大，抗原抗體更易形成緊密的結(jié)合物。王森 等（2012）優(yōu)化金標(biāo)抗體、羊抗鼠IgG和人工結(jié)合抗原制劑，成功研發(fā)出了瘦肉精的三合一多功能膠體金快速檢測(cè)板，該板的檢出限低，準(zhǔn)確率高，適合瘦肉精的多殘留檢測(cè)。吳巧麗等（2012）借助沙丁胺醇-BSA 抗原和兔抗沙丁胺醇多克隆抗體-月炙體金標(biāo)記物，對(duì)GICA法中的檢測(cè)試劑的制備進(jìn)行了優(yōu)化，最低限濃度為2 ng/mL，檢測(cè)時(shí)長縮短到3 min，且與鹽酸克倫特羅的交叉反應(yīng)率僅為2．67%。

2．2 色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

2.2.1 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法作為半確證性的定量檢測(cè)法，適用于強(qiáng)極性和熱不穩(wěn)定的β-興奮劑及其代謝產(chǎn)物，假陽性率低、專屬性與選擇性強(qiáng)，分離度和檢測(cè)精度高，且可獲得有關(guān)β－興奮劑分子結(jié)構(gòu)方面的信息。但HPLC法的樣品前處理過程繁瑣，除不進(jìn)行試樣衍生化外，其他步驟如提取、純化和定容都與氣相色譜質(zhì)譜法相同。在對(duì)畜產(chǎn)品的檢測(cè)過程中，為了實(shí)現(xiàn)達(dá)到分析、過程的自動(dòng)化，提升反應(yīng)的靈敏度，HPLC法常與柱前提取、純化、柱后熒光衍生化反應(yīng)和質(zhì)譜（MS）等系統(tǒng)連用。王鶴佳等（2014）依靠超高效液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC/Q-TOF MS）技術(shù)，分析和判斷出鹽酸克倫特羅在豬尿中的代謝產(chǎn)物，并由此推測(cè)鹽酸克倫特羅在豬體內(nèi)的主要代謝途徑。孟文瑛等（2012）為測(cè)定鹽酸克倫特羅研發(fā)了快捷精準(zhǔn)的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 ( SPEUPLC-MS/MS) 法，該方法最低檢出限為0．05 μg /kg，并在0．25～50 μg /kg的范圍內(nèi)擁有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）

氣象色譜-質(zhì)譜法作為被國際上定為β-興奮劑檢測(cè)的最終確證方法，在靈敏度方面較HPLC更高，對(duì)于假陽性率而言較ELISA更低。在樣品多殘留的檢測(cè)情況下，可對(duì)某一殘留物進(jìn)行定性、定量分析，且具有較高檢測(cè)極限。但因樣品前處理時(shí)間長、需要衍生化處理，操作技術(shù)要求高，儀器昂貴等因素，近幾年對(duì)此研究的熱點(diǎn)為提高該檢測(cè)方法的速度和靈敏度。田苗（2010）在對(duì)豬組織中β-興奮劑的檢測(cè)時(shí)，借助陽離子交換柱的凈化作用，將雙三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷作為衍生劑，有效降低檢出限至1 μg /kg，且具有良好的線性相關(guān)。Wang等（2006）建立了能夠檢測(cè)豬肝臟和豬尿中殘留萊克多巴胺的免疫親和色譜柱萃取IAC-GCMS法，檢測(cè)限為0．5 ng/mL。由于需要復(fù)雜的衍生化，且處理試劑大多具有較強(qiáng)的毒性，現(xiàn)越來越傾向于使用液相色譜-質(zhì)譜法作為定量分析的檢測(cè)方法。

2.2.3 液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）

液相色譜-質(zhì)譜法與氣相色譜-質(zhì)譜法相似，除了不需要衍生化外，試樣提取和純化等前處理步驟是統(tǒng)一的。實(shí)驗(yàn)室中可先對(duì)樣品進(jìn)行LC-MS測(cè)定，再對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理來進(jìn)行GC-MS測(cè)定。該方法適用于大分子量、難揮發(fā)、高沸點(diǎn)、極性與極不穩(wěn)定的化合物，目前主要用于檢測(cè)鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺等常見β－興奮劑。在此方法的基礎(chǔ)上，又有人將具有高分離能力的液相色譜和能有效提供分子結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜聯(lián)合起來，研發(fā)出了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS），不僅具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，還能在準(zhǔn)確檢測(cè)殘留濃度之余獲得豐富有效的化合物結(jié)構(gòu)信息。Wu 等（2014）借助LC-MS方法，結(jié)合萊克多巴胺在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，證實(shí)在停止給藥24 d后，豬毛中仍有部分克倫特羅的殘留。汪輝等（2015）根據(jù)β-興奮劑的酸堿性，于酸性條件下對(duì)試樣進(jìn)行酶解和提取，最后通過LC-MS法分析的檢測(cè)限為0．004 ng/mL 。

3 小結(jié)

隨著現(xiàn)有檢測(cè)方法的不斷改進(jìn)，β-興奮劑的檢測(cè)技術(shù)日益成熟，常見檢測(cè)方法在現(xiàn)場大批量初篩和最后確證方面都發(fā)揮著不容小覷的作用。今后的改進(jìn)和研發(fā)可朝著更高效、實(shí)惠的多殘留同時(shí)檢測(cè)方向進(jìn)行。

略。

2015-09-08)

第九屆本科生創(chuàng)業(yè)、科研基金項(xiàng)目（20150901008）；江西省農(nóng)牧漁業(yè)科研項(xiàng)目

聶婉（1995-），女，本科生，專業(yè)：生物科學(xué)。E-mail：995237428@qq.com。

*通訊作者，王琤韋華（1982-），男，講師，博士，研究方向：動(dòng)物營養(yǎng)。E-mail：616051233@qq.com。