響應面試驗優化超臨界CO2酯交換法制備低能SLS型結構脂質工藝

張家明，許多現，李相昕，齊曉芬，張 旭，于殿宇*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

響應面試驗優化超臨界CO2酯交換法制備低能SLS型結構脂質工藝

張家明，許多現，李相昕，齊曉芬，張 旭，于殿宇*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

在超臨界CO2狀態下，采用脂肪酶RMIM催化乙酸乙酯與一級大豆油反應制備SLS型結構脂質，分別應用單因素試驗和響應面試驗考察酶用量、反應壓力、溫度和時間對乙酸乙酯轉化率的影響。結果表明，最佳工藝條件為酶用量2.9%、反應時間13.1 h、反應壓力9.4 MPa、反應溫度49.0 ℃，此條件下乙酸乙酯的轉化率可達到36.1%，經純化后獲得純度為90.3%、熱值為22.35 kJ/g的SLS型結構脂質，與普通大豆油相比，熱值降低了42%。

超臨界CO2；脂肪酶；結構脂質；乙酸乙酯轉化率

油脂能賦予食品獨特的口感與風味，是食品的重要組成部分，但高脂肪的攝入會引起肥胖、某些癌癥和心血管疾病等[1-3]。目前，肥胖病人及相關疾病在逐年增加，因而，開發口感、風味等性質與天然油脂相同，而發熱量較低的低能油脂已成為人們研究的熱點[4-6]。

酯交換生產低能油脂主要有化學法和酶法兩種[7]。傳統的酯交換生產低能油脂產品主要是采用化學催化法合成，但此法存在著反應溫度高、化學污染嚴重、產物色澤差等缺點；目前，國內外多以酶催化法合成，該法在有機溶劑和無溶劑中反應都取得了較好進展，但在超臨界二氧化碳（supercritical CO2，SC-CO2）狀態酶法催化合成低能油脂鮮有相關報道。SC-CO2狀態下酶反應，是近年來生物工程新開拓的領域[8-9]。當CO2達到臨界溫度（31.1 ℃）和壓力（7.28 MPa）以上時，物理性質介于流體和氣體之間，CO2顯示出較大的溶解能力和較高傳遞特性，從而可大大降低酶反應過程的傳質阻力，提高酶反應速率[10]；另外，SC-CO2無毒、不可燃、化學惰性佳、易與反應物底物分離[11-13]。這些優點和特點使其在食品工業上的應用具有廣闊的發展前景。由于乙酸酸性較強，在反應體系中可能會影響脂肪酶的活性，體系中乙酸的含量過高也會產生大量的羧基基團，從脂肪酶表面奪走部分必需水，而且可以從油水界面進入到周圍的水層中，導致底物抑制效應的發生[14]。因此，本實驗以乙酸乙酯和一級大豆油為原料，對超臨界狀態下利用1,3特異性脂肪酶催化合成低能SLS型結構脂質進行研究，探討反應壓力、反應溫度、反應時間和酶用量對轉化率的影響，進而最大限度地合成Sn-1、Sn-3為短鏈、Sn-2為長鏈的長短鏈脂肪酸甘油三酯（SLS型結構脂質）。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆一級油 九三糧油工業集團有限公司；無水乙醇、冰醋酸（分析純） 黑龍江雙城市鑫田化學試劑制造有限公司；固定化脂肪酶RMIM（酶活力275 IUN/G）丹麥諾維信公司；CO2（純度＞99.99%） 北京京高氣體有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；高壓反應釜威海新元化工機械有限公司；ZK-GT2A型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；XW-80A 微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；RE-51A 型旋轉蒸發器上海博通經貿有限公司；DF-101 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海卓康生物科技有限公司；分子蒸餾儀 德國UIC gmbh公司；GC-14B氣相色譜儀 日本島津公司；ZDHW-5000微機全自動量熱儀 鶴壁華源儀器。

1.3 方法

1.3.1 乙酸乙酯的制備

在50 mL圓底燒瓶中加入9.5 mL（0.2 mol）無水乙醇和6 mL（0.1 mol）冰醋酸，再小心加入2.5 mL濃硫酸，混勻后加入沸石，再裝上冷凝管。小心加熱反應瓶，緩慢回流0.5 h，冷卻反應物，將回流裝置改成蒸餾裝置，接受瓶用冷水冷卻，蒸出生成的乙酸乙酯，直到餾出液約為反應物總體積的1/2為止。在餾出液中慢慢加入飽和碳酸鈉振蕩至不再有CO2氣體產生為止。將混合液轉入分液漏斗，分去下層水溶液，有機層用5 mL飽和氯化鈉洗滌，再用5 mL氯化鈣洗滌，最后用水洗滌一次，分去下層液體。有機層倒入干燥三角燒瓶中，用無水硫酸鎂干燥。將干燥后的有機物進行蒸餾，收集72～78 ℃餾分乙酸乙酯，稱量收集到的乙酸乙酯的質量。

1.3.2 酶促酯化

在高壓反應釜中按2∶1的物質的量比加入乙酸乙酯與一級大豆油和2%的水分，同時加入轉子和一定量的脂肪酶，將反應釜密封后充入少量CO2以置換出反應釜中的空氣，同時試漏，確定反應釜密封情況良好后，在加壓泵的作用下充入CO2使反應釜內達到一定壓力，然后將反應釜置于水浴鍋中，調節磁力攪拌器的轉速至120 r/min，在一定溫度條件下反應一定時間。

1.3.3 乙酸乙酯含量的檢測

采用薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法進行乙酸乙酯的定量和定性分析[15-17]。

1.3.4 酯交換率計算

式中：C0為反應初始體系中乙酸乙酯的單位含量/（g/g）；C1為反應完畢后體系乙酸乙酯的單位含量/（g/g）。

1.3.5 產品的純化

反應完畢后，取出轉子，將反應釜內的物質高速離心除去固定化脂肪酶，取上述物質裝入分子蒸餾的物料瓶中，在冷阱中裝入液氮后，打開真空泵，對反應產物脫氣，待脫氣完畢后，設定所需的蒸餾溫度100 ℃、真空度0.5～0.8 Pa，固定冷凝面溫度5 ℃，設定蒸餾刮膜轉速為150 r/min，調節進料閥保持進料流量約為1.5 mL/min（1 滴/3 s），進而進行分子蒸餾純化（在蒸餾過程中視液氮揮發程度及時補充冷阱中的液氮），對所得餾出物（主要成分為脂肪酸乙酯、乙酸乙酯、單甘酯、甘二酯等）和餾余物（重相主要成分為甘油三酯）分別進行收集，將得到的餾余物利用壽佳菲等[18]在中長鏈脂肪酸甘油三酯的制備與分離純化研究中的分離純化方法，獲得提純后的產物并利用氣相色譜[19]對其進行定性分析，從而確定獲得產物中以SLS型結構脂質為主。再次利用壽佳菲等[18]研究，對所得產物進行進一步的純度檢測，按式（2）計算SLS型結構脂質的純度：

1.3.6 低能SLS型結構脂質制備工藝優化

在單因素試驗的基礎上，對反應壓力、反應溫度、反應時間、酶用量采用Box-Behnken試驗進行優化，以確定制備低能SLS型結構脂質工藝條件，響應面試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.7 產品指標的測定

碘值的測定：參照GB/T 5532—2008《動植物油脂碘值的測定》；酸值的測定：參照GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》；過氧化值的測定：參照GB/T 5538—2005《動植物油脂過氧化值的測定》；皂化值的測定：參照GB/T 5534—2008《動植物油脂皂化值的測定》；大豆油色澤的測定：參照GB/T 22460—2008《動植物油脂羅維朋色澤測定》；油脂熱值的測定：參照粟智等[20]的研究。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶用量對乙酸乙酯轉化率的影響

酶用量分別取 1%、2%、3%、4%、5% 時，固定反應壓力9 MPa、反應溫度50 ℃、反應時間11 h，酶用量對乙酸乙酯轉化率的影響見圖1。

圖1 酶用量對乙酸乙酯轉化率的影響Fig.1 Effect of RMIM lipase concentration on ethyl acetate conversion rate

在超臨界高壓條件下，脂肪酶活力基本不受影響[21]。由圖1可知，隨著酶用量的增加，乙酸乙酯的轉化率也隨之提高，但當酶用量達到3%以上時，乙酸乙酯轉化率的增加趨勢不明顯，這可能是隨著酶用量的增加，酶分子與底物接觸的機會增加，反應速率加快，酯化反應程度提高，但酶用量達到3%后由于酶用量過高時，水解反應所需的水分子不足，不能及時為水解提供所需的水分，導致反應不能及時進行。同時脂肪酶價格較高，出于成本考慮，酶用量選擇3%最為適宜。

2.1.2 反應時間對乙酸乙酯轉化率的影響

反應時間分別取 7、9、11、13、15 h 時，固定酶用量3%、反應壓力9 MPa、反應溫度50 ℃，反應時間對乙酸乙酯轉化率的影響見圖2。

圖2 反應時間對乙酸乙酯轉化率的影響Fig.2 Effect of reaction time on ethyl acetate conversion rate

由圖2可知，開始時，隨著反應時間的延長，乙酸乙酯的轉化率不斷提高，但反應時間達到13 h后上升效果不再顯著，這可能是因為隨著反應時間延長，底物質量濃度減少和酶活力下降，使反應速率逐漸減慢，轉化率的增長趨于平緩。綜合考慮反應時間以13 h為宜。

2.1.3 反應壓力對乙酸乙酯轉化率的影響

反應壓力分別取7、8、9、10、11 MPa時，固定酶用量3%、反應溫度50 ℃、反應時間13 h，反應壓力對乙酸乙酯轉化率的影響見圖3。

圖3 反應壓力對乙酸乙酯轉化率的影響Fig.3 Effect of reaction pressure on ethyl acetate conversion rate

壓力對脂肪酶本身體系影響不大，主要是它影響了SC-CO2的性質，從而影響反應速率及轉化率[22]。由圖3可知，隨著反應壓力的增加，反應速率加快，從而可相應縮短反應時間，當壓力達到10 MPa以上時，乙酸乙酯轉化率的提高不再顯著，因此反應壓力10 MPa較為適宜。

2.1.4 反應溫度對乙酸乙酯轉化率的影響

反應溫度分別取30、40、50、60、70 ℃時，固定酶用量3%、反應壓力10 MPa、反應時間13 h，反應溫度對乙酸乙酯轉化率的影響見圖4。

圖4 反應溫度對乙酸乙酯轉化率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on ethyl acetate conversion rate

由圖4可知，當溫度從30 ℃升至50 ℃時，乙酸乙酯的轉化率隨之逐漸上升，這說明隨著溫度的升高，脂肪酶的催化活性部位逐漸暴露，發揮出較強的活性。當溫度達到50 ℃時，脂肪酶催化活性達到極值，之后酯化程度開始下降，這有可能是較高溫度致使酶部分失活而引起的。可見，脂肪酶RMIM在催化酯化反應的最佳溫度在50 ℃左右。

2.2 響應面試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken設計[23-24]，以酶用量（A）、反應時間（B）、反應壓力（C）、反應溫度（D）為自變量，以乙酸乙酯轉化率為響應值設計四因素三水平響應面試驗。試驗設計方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案及結果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

根據表2中乙酸乙酯轉化率試驗數據，應用Design-Expert 7.5.0軟件對試驗結果進行方差分析，所得主要分析結果見表3。

通過對試驗所得數據進行回歸擬合，得到乙酸乙酯轉化率（Y）對自變量酶用量（A）、反應時間（B）、反應壓力（C）和反應溫度（D）的回歸方程為：

Y=35.15－0.55A＋0.98B＋3.82C＋0.11D－0.55AB－0.59AC＋0.12AD－1.68BC＋1.55BD－2.73CD－3.46A2－3.22B2－5.26C2－4.48D2

表3 回歸變量方差分析結果Table3 Analysis of variance of regression model

從表3可以看出，失擬項P值為0.422 8＞0.05，表明失擬不顯著。模型的P值是0.000 1，可知該模型的預測值與實測值比較相符的；方程的相關系數R2為0.924 5，調整后的R2為0.863 4，表明模型可以解釋86.34%的超臨界條件乙酸乙酯轉化率水平的變化，進一步說明了回歸方程的擬合程度較好。

根據上述回歸方程繪出響應面分析圖，以確認酶用量、反應時間、反應壓力、反應溫度4 個因素對轉化率的影響，響應面見圖5。

圖5 不同因素對乙酸乙酯轉化率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots for the interactive effects of different factors on ethyl acetate conversion rate response

三維響應面圖可用來直觀地表達各因素之間的相互作用[25]。任取兩個因素為自變量，固定其他因素使其編碼值為零水平，可以通過回歸方程計算出相應的響應值，繪出兩個因素與乙酸乙酯轉化率之間關系的響應面，可以更直觀地觀察兩因素的相互影響情況。最大的橢圓，即最外圍的橢圓代表在該圓上取值時，乙酸乙酯轉化率最低，而最小的橢圓則表示在其上面取值時，乙酸乙酯轉化率最高，最小與最大之間的等高線代表乙酸乙酯轉化率逐漸變化。

對回歸方程求一階偏導數，當響應值乙酸乙酯轉化率取最大值時，所得4 個因素最佳水平真實值分別為酶用量2.88%、反應時間13.07 h、反應壓力9.39 MPa、反應溫度48.99 ℃，對應乙酸乙酯轉化率的最大值為35.94%。對4 個因素值進行整理得到相應條件為酶用量2.9%、反應時間13.1 h、反應壓力9.4 MPa、反應溫度49.0 ℃。為了檢驗運用響應面方法分析所得結果的可靠性，按照上述整理值進行實驗，得到的乙酸乙酯轉化率為36.1%。預測值與實測值之間具有良好的擬合性，從而證實了模型的有效性。

2.3 產物的定性分析及純度

對分離純化后的產物進行甲酯化，利用氣相色譜檢測出脂肪酸中乙酸的總含量為65.93%；利用脂肪酶RMIM對產物進行專一性切割，純化后得到2-單甘酯，再對其進行甲酯化，利用氣相色譜測得2-單甘酯所含脂肪酸中乙酸的含量為10.01%，通過計算可知Sn-2位的乙酸含量為產物中脂肪酸總量的3.33%，又已知脂肪酸中乙酸總量為65.93%，所以Sn-1,3位所含乙酸含量為62.60%。若Sn-1位上的脂肪酸全部為乙酸（33.33%），則余下的乙酸在Sn-3位上即含量為29.30%，此時所得到的提純產物中SLS型結構脂質的最小含量為87.99%；若Sn-1,3位所含乙酸含量相同（31.30%），此時得到的SLS型結構脂質最大含量為93.99%，因此，經純化后的產物中一定存在SLS型結構脂質并且含量在87.99%～93.99%之間。對產物進一步進行純度檢測，得出SLS型結構脂質的純度為90.3%。

2.4 大豆油脂處理前后的檢測指標

表4 大豆油處理前后的檢測指標Table4 Sensory and physiochemical indicators of soybean oil and SLS-type structured lipid

由表4可知，經過超臨界CO2制備的SLS型結構脂質，其檢測指標均未發生明顯變化，實驗結果表明其各項理化指標完全符合行業生產應用要求，具有良好的應用性。

3 結 論

本實驗是在超臨界條件下利用酯交換法制取低能SLS型結構脂質，通過響應面法優化分析得到乙酸乙酯轉化的最優條件：酶用量2.9%、反應時間13.1 h、反應壓力9.4 MPa、反應溫度49.0 ℃。在此最優條件下進行酯交換反應，得到的乙酸乙酯轉化率為36.1%，經分子蒸餾純化后得到純度為90.3%，熱值為22.35 kJ/g的SLS型結構脂質，其熱值為普通大豆油的58%，達到了降低熱值的目的，可為以后工業化生產低能油脂提供依據。

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Process Optimization for Synthesis of Low-Energy SLS-Type Structured Lipid by Transesterifi cation in Supercritical CO2State Using Response Surface Methodology

ZHANG Jiaming, XU Duoxian, LI Xiangxin, QI Xiaofen, ZHANG Xu, YU Dianyu*
(School of Food Science and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In the supercritical CO2state, the synthesis of lipid with SLS-type structure from the Rhizomucor miehei lipase (Lipozyme RMIM)-catalyzed reaction between ethyl acetate and fi rst-grade soybean oil was investigated. The effects of enzyme concentration, reaction pressure, temperature and time on the conversion rate of ethyl acetate were examined by the combined use of single factor design and response surface methodology. The results showed that the optimal parameters for preparing SLS-type structured lipid were determined as follows: in the presence of 2.9% lipase RMIM, reaction at 49.0 ℃and 9.4 MPa for 13.1 h. Under these conditions, the conversion rate of ethyl acetate reached 36.1% and after purifi cation of the fi nal product, a purity of 90.3% and a caloricity of 22.35 kJ/g (reduced by 42% as compared with that of ordinary soybean oil) were obtained.

supercritical CO2; lipase; structured lipid; ethyl acetate conversion rate

TS224.8

A

1002-6630（2015）20-0067-06

10.7506/spkx1002-6630-201520012

2015-02-09

東北農業大學大學生SIPT計劃項目（201410224036）

張家明（1992—），男，本科，研究方向為食品科學與工程專業。E-mail：1742186793@qq.com

*通信作者：于殿宇（1964—），男，教授，博士，研究方向為糧油精深加工技術。E-mail：dyyu2000@126.com