響應面試驗優化葡萄籽油提取工藝及其抗氧化性

胡翠珍，李 勝，馬紹英,*，蘇利榮，曹寶臣，周文政，劉 琦

（1.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅順意生物科技有限公司，甘肅 張掖 743000；3.張掖匯通生物科技有限 公司，甘肅 張掖 743000）

響應面試驗優化葡萄籽油提取工藝及其抗氧化性

胡翠珍1，李 勝1，馬紹英1,*，蘇利榮1，曹寶臣1，周文政2,3，劉 琦1

（1.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅順意生物科技有限公司，甘肅 張掖 743000；3.張掖匯通生物科技有限 公司，甘肅 張掖 743000）

目的：優化葡萄籽油的提取工藝，對葡萄籽油的抗氧化性進行研究。方法：通過響應面分析法，對葡萄籽油的提取工藝進行優化；比較不同物質的抗氧化性，以對超氧陰離子自由基、羥自由基、亞硝基的清除率和還原能力的大小為檢測指標。結果：萄萄籽油最佳提取條件為提取溫度58.136 ℃、提取時間1.703 h、料液比1∶5.627。優化后提取的萄萄籽油對超氧陰離子自由基的清除能力高于同等質量濃度的沙棘黃酮；對羥自由基的清除能力高于抗壞血酸；對亞硝基的清除能力顯著高于抗壞血酸和沙棘黃酮；還原能力比較中，高于沙棘黃酮和抗壞血酸。結論：該工藝條件可行，葡萄籽油具有良好的抗氧化性。

葡萄籽；葡萄籽油；響應面法；抗氧化性

葡萄約占世界水果總量的23.6%，可用做釀酒、鮮食、加工果汁和其他葡萄制品。我國葡萄資源豐富，每年用于釀酒鮮食和加工的葡萄達80萬 t[1]。生產中產生的葡萄廢棄物約占葡萄鮮果總量的20%～30%[2]，其中葡萄籽占整個葡萄粒質量的5%左右[3]。葡萄籽中含有多種營養成分，其中6%～22%為葡萄籽油[4]，3.9%為原花青素，白藜蘆醇含量為0.5%～3.5%。另外還含有單寧、葡萄籽蛋白質、VE和各種礦物質等[5]，具有較高的開發利用價值。

目前關于葡萄籽油的提取方法主要有冷榨法[6]、超聲波輔助提取法[7-8]、超臨界CO2萃取法[9]、有機溶劑提取法、水酶法[10-11]。本實驗擬利用石油醚作為提取劑，并利用響應面法優化提取工藝，以期為葡萄籽油的生產提供技術參考和理論依據。

自由基能引起多種器官功能異常或組織病變[12]，如癌癥和衰老的發病機理與脂質過氧化有關[13]。天然抗氧化劑可以清除體內產生過剩的自由基[14]，從而延緩衰老、預防癌癥。常見的天然抗氧化劑有原花青素、白藜蘆醇、黃酮、VE等[15]。葡萄籽油含有大量的不飽和脂肪酸，其含量占脂肪酸的92%[16]，主要成分亞油酸含量較一般食用油，甚至較藥用核桃油和紅花油含量都高[4,17]。葡萄籽油含有較高的VE，較低的膽固醇，具有抗氧化性[18-19]，可作為優質的食用油。葡萄籽油具有多種生物學功效，如降低 血脂、軟化血管、預防血管硬化、降低血壓、降低血液黏度和防止血栓形成等。本研究擬比較原花青素、白藜蘆醇、沙棘黃酮、抗壞血酸與葡萄籽油的抗氧化性，以期為其開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽（當年收獲）、原花青素（由葡萄籽皮渣中提取，純度為65%） 甘肅順意公司；石油醚（分析純）、抗壞血酸（分析純） 天津光復精細化工研究所；活性白土（CAS號：8515-07-1） 青島玉洲化工有限公司；白藜蘆醇（純度10%） 西安天本生物工程有限公司；沙棘黃酮（純度48%） 實驗室從沙棘中提取。

1.2 儀器與設備

DT10 00電子天平 上海精密科學儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇榮華儀器制造有限公司；旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；循環式水浴真空泵鄭州長城科工貿有限公司；SP-756P紫外-可見分光光度計 上海光譜公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄籽油的提取

有機溶劑浸提法：準確稱取烘干至恒質量、質量為100 g、粉碎至60目的葡萄籽粉于錐形瓶中，加入適量的石油醚，密封，在恒溫水浴鍋中浸提。倒出提取液，以10∶8（mL/g）液料比加入活性白土，攪拌均勻，抽濾除去雜質，用旋轉蒸發儀回收溶劑除去殘留溶劑，直至兩次質量差不超過0.002 g為止，得葡萄籽油，冷卻，稱量。葡萄籽油提取率按式（1）進行計算：

1.3.2 單因素試驗

表1 單因素試驗設計Table1 Single-factor design

按照1.3.1節所述方法提取葡萄籽油，研究不同提取溫度、料液比、提取時間及提取次數對葡萄籽油提取率的影響，每次試驗重復3 次，試驗過程中，各因素水平設計見表1。

1.3.3 響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，根據中心組合試驗設計原理，以提取溫度、提取時間、料液比3 個因素為自變量，設計響應面試驗。分別用A、B、C表示，響應面分析因素與水平見表2。

表2 響應面分析因素與水平Table2 Independent variables and their levels used in central composite dessiiggnn

1.3.4 超氧陰離子自由基清除率的測定

依據程德竹等[20]不同物質對鄰苯三酚自氧化生成超氧陰離子自由基清除的方法改進。取0.05 mol/L pH值為9的Tris-HCl緩沖液4.5 mL，置于25 ℃水浴中預熱20 min，分別加入1 mL試樣和0.4 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應5 min，加入2 mol/L HCl溶液2.0 mL 終止反應，以Tris-HCl緩沖液作參比，在320 nm波長處測定吸光度A1，以等體積的蒸餾水代替樣品和鄰苯三酚溶液，測吸光度A0，計算清除率。清除率計算如式（2）所示：

1.3.5 羥自由基清除率的測定

采用顏軍等[21]的方法改進。將7.5 nmol/L硫酸亞鐵溶液、7.5 nmol/L過氧化氫溶液、7.5 nmol/L 70%的水楊酸-甲醇溶液、一定質量濃度的試樣按順序加入到試管中，振蕩靜置10 min，以蒸餾水為參比，于510 nm波長處測吸光度，代入式（3）計算清除率。

式中：A0為2 mL硫酸亞鐵＋2 mL水楊酸乙醇溶液＋5 mL蒸餾水＋2 mL過氧化氫吸光度；Ai為2 mL硫酸亞鐵＋2 mL水楊酸乙醇溶液＋5 mL樣品液＋2 mL過氧化氫吸光度；Aj為2 mL硫酸亞鐵＋2 mL蒸餾水＋5 mL樣品液＋2 mL過氧化氫吸光度。

1.3.6 亞硝基清除率的測定

根據沈彬等[22]的方法改進。準確量取2 mL 5 mg/L NaNO2溶液6 份，置于20 mL具塞試管中，分別加入不同質量濃度的樣品液，在37 ℃恒溫水浴中反應10 min，立即加入0.4%對氨基苯磺酸2 mL，搖勻靜置4 min，加入2.0%鹽酸萘乙二胺溶液1 mL，搖勻，靜置15 min，以等體積的蒸餾水代替NaNO2溶液調零，于540 nm波長處測吸光度，按式（4）計算樣品液對亞硝基的清除率：

式中：A0為未添加樣品的吸光度；Ai為樣品的吸光度；Aj為樣品本底的吸光度。

1.3.7 還原能力的測定

采用黃仁術等[23]的方法改進，測定還原能力。取不同質量濃度的樣品溶液1.25 mL，加入0.2 mol/L、pH 6.6的磷酸鹽緩沖液1.25 mL和0.1%的鐵氰化鉀溶液1.25 mL，50 ℃水浴20 min后迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液1.25 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加蒸餾水2 mL及0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻，放置10 min，于700 nm波長處測吸光度。吸光度越大，說明還原能力越強[24]。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對有機溶劑提取葡萄籽油的影響

圖1 不同料液比條件下葡萄籽油提取率Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on grape seed oil yield

由圖1可以看出，料液比在1∶6之前時，隨著溶劑用量的增加，葡萄籽粉與石油醚接觸面積增加，葡萄籽油提取率增加（可達14.63%），但當料液比達到1∶7時，葡萄籽油的提取率隨著溶劑用量的增大并未增加，因此考慮能耗因素，料液比為1∶6時較適宜。

2.1.2 提取時間對有機溶劑提取葡萄籽油的影響

由圖2可知，葡萄籽油的提取率隨著提取時間的延長而增加，2 h達到最大值為11.44%，隨后，葡萄籽油的提取率開始下降，可能是隨著時間的延長，油脂揮發，提取率下降，所以選擇2 h的提取時間為宜。

圖2 不同提取時間條件下葡萄籽油提取率Fig.2 Effect of extraction time on grape seed oil yield

圖3 不同提取溫度條件下葡萄籽油提取率Fig.3 Effect of extraction temperature on grape seed oil yield

2.1.3 提取溫度對有機溶劑提取葡萄籽油的影響由圖3可知，隨著提取溫度的升高，葡萄籽油的提取率也隨之增大，55 ℃時達到最大值11.44%，而當溫度過高，提取率略有下降，溫度影響提取率的主要原因是石油醚的沸騰和流動性，隨著溫度的升高提取黏度減少，擴散系數增加，石油醚與葡萄籽接觸充分，提取率不斷上升，但當溫度過高時，達到石油醚沸點，石油醚揮發，溶劑量減少，葡萄籽油的提取率反而下降，因此當浸提溫度為55 ℃時較為適宜。

2.1.4 提取次數對有機溶劑提取葡萄籽油的影響

圖4 不同提取次數條件下葡萄籽油提取率Fig.4 Effect of extraction number on grape seed oil yield

由圖4可知，隨著提取次數的增加，葡萄籽油的提取率也隨之增加，葡萄籽油的最大提取率為11.73%。但由于隨著提取次數的增加，葡萄籽油的提取率并沒有顯著增加，因此考慮能耗因素，選擇1次為最佳提取次數。

2.2 響應面優化葡萄籽油的提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計與結果

以葡萄籽油提取率為響應值設計了三因素三水平共20 個試驗點的響應面分析試驗，20 個試驗點包括17 個分析因點和3 個零點，以隨機次序進行，重復3 次獲得響應值，用Design-Expert 9.0.3對表3中的試驗數據進行回歸分析，擬合二次多項式方程，方程可靠性由R2表示，其統計學上的顯著性由F值檢驗，影響因素線性效應、平方效應及其交互效應的顯著性由模型系數的P值檢驗。

表3 響應面設計與試驗結果Table3 Central composite design with experimental values of grape seed oil yield

2.2.2 葡萄籽油提取率預測模型方程的建立及顯著性分析

用Design-Expert 9.0.3軟件對表3中的試驗結果進行分析后得到二階響應表面模型方程：Y=14.24＋0.56A－0.31B＋0.33C－0.079AB－0.65AC＋0.66BC－0.67A2－0.51B2－0.63C2。對回歸方程進行方差分析，結果見表4。

表4 回歸方程顯著性檢驗Table4 Analysis of variance of regression equation and signifi cant test

從表4可以看出，模型顯著性檢驗P＜0.05，表明該模型具有統計學意義。失擬項用來表示所用模型與實驗擬合的程度，即二者差異的程度。失擬項P值為0.894 8＞0.05，表明失擬不顯著，該模型能夠較好地描述各因素與響應值之間的真實關系；模型的校正決定系數j為0.918 2，說明該模型能解釋約91.82%響應值的變化；決定系數R2=0.957 0，說明該模型擬和程度良好，試驗誤差小。可以利用該回歸方程確定葡萄籽油的最佳提取工藝條件。通過該方程，各因素之間存在著一定的交互作用，其中A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2均呈極顯著影響，AB呈不顯著。

從單因素水平觀察，可以得出其影響順序為：提取溫度＞料液比＞提取時間。在有交互作用存在條件下，對葡萄籽油提取率的影響順序為：BC＞AC＞AB。

2.2.3 各因素的交互作用的響應面

圖5 各因素交互作用對葡萄籽油提取率的影響Fig.5 Interactive effects of various factors on grape seed oil yield

根據圖5中響應面及圖中的等值線的形狀分析提取溫度、提取時間、料液比3 個因素對葡萄籽油提取率的影響。響應面圖像曲線走勢越陡，其影響越顯著；走勢越平滑，其影響越小。由圖5可以看出，響應面存在極值，即響應面有最高點。進一步通過Design-Expert 9.0.3軟件分析計算可知，當提取溫度58.136 ℃、提取時間1.703 h、料液比1∶5.627時，回歸模型預測理論葡萄籽油提取率可達14.45%。對分析結果進行驗證實驗，在提取溫度58 ℃、提取時間1.7 h、料液比1∶6時，葡萄籽油的提取率為14.03%，驗證值略低于預測值，其相對誤差為3.009%，二者非常接近，因此該工藝穩定可行，適用于葡萄籽油的提取。

2.3 葡萄籽油的抗氧化性

2.3.1 對超氧陰離子自由基的清除作用

圖6 不同物質對超氧陰離子自由基清除作用的比較Fig.6 Superoxide anion radical scavenging capacities of grape seed oil and other natural antioxidants

由圖6可以看出，葡萄籽油在6 mg/mL時，對超氧陰離子自由基的清除率顯著高于同等質量濃度的白藜蘆醇、抗壞血酸和沙棘黃酮。隨著質量濃度的變化，只顯著高于沙棘黃酮，且與同等質量濃度的原花青素、白藜蘆醇和抗壞血酸相比并無顯著性差異。由此可見，葡萄籽油與其他常見的抗氧化劑一樣對超氧陰離子自由基具有較強的清除作用。

2.3.2 對羥自由基的清除作用

圖7 不同物質對羥自由基清除作用的比較Fig.7 Hydroxyl radical scavenging capacities of grape seed oil and other natural antioxidants

由圖7可知，葡萄籽油對羥自由基的清除率顯著高于沙棘黃酮。在低質量濃度時，略高于白藜蘆醇。當質量濃度達到84 μg/mL時，顯著高于原花青素、白藜蘆醇和抗壞血酸。隨著質量濃度的增高，對羥基自由的清除率顯著低于同等質量濃度的原花青素。

2.3.3 對亞硝基的清除作用

圖8 不同物質對亞硝基清除作用的比較Fig.8 Nitroso radical scavenging capacities of grape seed oil and other natural antioxidants

由圖8可以看出，在低質量濃度（2 mg/mL）條件下，葡萄籽油對亞硝基的清除率最低。但隨著質量濃度的增加，與同等質量濃度的原花青素對亞硝基的清除率無顯著差異，并顯著高于同等質量濃度條件下的抗壞血酸和沙棘黃酮，但顯著低于白藜蘆醇對亞硝基的清除率。

2.3.4 還原能力

圖9 不同物質還原能力的比較Fig.9 Reducing power of grape seed oil and other natural antioxidants

由圖9可知，在低質量濃度（小于56 μg/mL）時，葡萄籽油的還原能力略高于白藜蘆醇；但當質量濃度增加，葡萄籽油的還原能力顯著低于同等質量濃度的原花青素和白藜蘆醇。隨著質量濃度的變化，葡萄籽油的還原能力均顯著高于同等質量濃度的沙棘黃酮和抗壞血酸。

3 討論與結論

葡萄籽油含有大量的不飽和脂肪酸和VE，較低的膽固醇，可作為優質的食用油，但其提取技術一直是制約其大規模生產的問題之一。冷榨法出油率低，在柴佳等[6]的研究中，出油率僅為12.3%；超聲波輔助提取噪音大；CO2超臨界萃取法對設備要求嚴格；水酶提取法提取所使用酶價格高，提取工藝復雜，不利于大規模生產；有機溶劑提取法能耗低，溶劑可循環利用，利于大規模生產。

本研究通過考察提取溫度、提取次數、提取時間及料液比4 組單因素水平對葡萄籽油提取率的影響，最終篩選出3 組主要因素進行響應面試驗設計，優化了提取條件，建立了影響葡萄籽油提取率的二次多項數學模型。經檢驗該模型具有顯著的統計學意義，可用于生產預測。

試驗結果表明提取溫度、提取時間、料液比各因素及其二項式對葡萄籽油提取率均有顯著影響。綜合考慮各方面的因素，葡萄籽油提取優化條件為提取溫度58.136 ℃、提取時間1.703 h、料液比1∶5.627，葡萄籽油提取率理論達到最大值為14.45%。經驗證得14.03%，其相對誤差為3.009%，表明該提取工藝參數在葡萄籽油的提取中是可行的。

活性氧自由基對機體有一定的毒害作用，如進攻多不飽和脂肪酸可引起脂質過氧化，導致生物膜結構和功能的改變；引發蛋白質氧化變性、核酸損傷和酶失活[25]，并能激活程序性細胞死亡。因此生物體內活性氧的生成與清除的平衡對生命過程的正常進行是十分重要的。近年來，油脂的抗氧化作用受到廣泛的重視，研究表明許多油脂具有清除自由基的作用。

比較不同物質之間的抗氧化能力，葡萄籽油對超氧陰離子自由基的清除能力高于同等質量濃度的沙棘黃酮；對羥自由基的清除能力高于抗壞血酸；對亞硝基的清除能力比較，顯著高于抗壞血酸和沙棘黃酮；還原能力比較中，高于沙棘黃酮和抗壞血酸。因此，葡萄籽具有良好的抗氧化能力，研究為其開發利用提供了理論依據。

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Optimization of Extraction Process for Grape Seed Oil by Response Surface Methodology and Evaluation of Its Antioxidant Properties

HU Cuizhen1, LI Sheng1, MA Shaoying1,*, SU Lirong1, CAO Baochen1, ZHOU Wenzheng2,3, LIU Qi1
(1. College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Gansu Shunyi Bio-Technology Co. Ltd., Zhangye 743000, China; 3. Zhangye Huitong Bio-Technology Co. Ltd., Zhangye 743000, China)

Objective: To optimize the extraction of grape seed oil and investigate its antioxidant properties. Methods: Response surface methodology was applied to optimize the extraction process. Antioxidant properties of grape seed oil were evaluated using superoxide anion, hydroxyl and nitroso radical scavenging and reducing power assays. Results: The optimum conditions for extracting grape seed oil were determined as extraction for 1.703 h at 58.136 ℃ with a solid/liquid ratio of 1:5.627. The grape seed oil obtained possessed superoxide anion radical scavenging capacity higher than that of seabuckthorn fl avones at the same concentration and hydroxyl radical scavenging capacity comparable to that of ascorbic acid without signifi cant difference, and its nitroso radical scavenging capacity and reducing power were signifi cantly higher than those of ascorbic acid and seabuckthorn fl avones. Conclusion: The optimized extraction conditions are feasible, and grape seed oil possesses good antioxidant potential.

grape seed; grape seed oil; response surface methodology; antioxidant activity

TS224.2

A

1002-6630（2015）20-0056-06

10.7506/spkx1002-6630-201520010

2015-04-28

甘肅省科技支撐計劃項目（1304FKCA065）；甘肅省高校基本科研經費項目

胡翠珍（1989—），女，碩士研究生，研究方向為天然產物的提取與開發。E-mail：zhonglarkspur@163.com

*通信作者：馬紹英（1975—），女，實驗師，碩士，研究方向為天然產物。E-mail：mashy@gsau.edu.cn