人參多糖提取工藝優化及其組成分析

張艷榮，樊紅秀，劉鴻鋮，張 穎，王大為*

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

人參多糖提取工藝優化及其組成分析

張艷榮，樊紅秀，劉鴻鋮，張 穎，王大為*

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

以超臨界脫脂、脫皂苷后的人參渣為原料，采用超臨界輔助熱水浸提法提取人參多糖，采用正交試驗確定提取人參多糖的最佳工藝條件。結果表明：在萃取壓力30 MPa、萃取溫度80 ℃、萃取時間1.5 h、物料粒度0.20 mm、原料-夾帶劑比例1∶2.5（g/mL）時，人參多糖提取率為（38.03±1.43）%，多糖純度為（54.71±2.16）%，與熱水浸提法相比，提取率和純度分別提高了16.15%和13.44%。采用高效液相色譜法和高效凝膠滲透色譜法對人參多糖中的單糖組成和多糖平均分子質量進行分析，發現人參多糖含有較多的葡萄糖以及少量的半乳糖、阿拉伯糖，且超臨界輔助熱水浸提法中這3 種單糖的含量均顯著高于熱水浸提法。超臨界輔助熱水浸提法與熱水浸提法提取的人參多糖重均分子質量分別為123 847 u和127 016 u，但是超臨界輔助熱水浸提法的人參多糖中多糖種類多于熱水浸提法。

超臨界輔助熱水浸提法；人參多糖；組成分析

人參是我國傳統的名貴中藥材，自2012年種植人參被批準為新資源食品以來，人參越來越成為科研工作者的寵兒[1-2]。人參經超臨界CO2萃取出人參油和皂苷后，剩余的人參渣中仍含有40%左右的多糖成分，而且物料沒有受有機溶劑污染和熱變性，仍是提取活性多糖的良好來源。研究[3-4]表明，人參多糖具有增強人體免疫功能、抗腫瘤、抗血栓、抗病毒等作用，在食品保健和醫藥方面都有很大的開發前景。

目前，人參多糖的提取方法有熱水浸 提法、超聲波提取法、微波提取法[5]等。熱水浸提法工藝簡單，成本低，能夠適應工業生產的需要[6]。但此法提取時間長，工序繁雜，一般只能提取細胞壁外多糖，對細胞壁內多糖作用不明顯，影響多糖的提取效率及生物活性[7]。超臨界CO2萃取技術是一門新型提取分離技術，具有操作方便、萃取速率快、選擇性強、無毒性等特點。由于超臨界CO2流體既有與液體相近的密度，又有與氣體相當的高滲透力和低黏度，可以和樣品充分地接觸。加入夾帶劑（如乙醇、水等）可以改善分子質量較大、極性較強的物質的提取效率，使得多糖等強極性物質的超臨界CO2萃取成為可能[8-10]。雖然利用超臨界CO2萃取技術提取植物多糖的已有報道，但還未見應用于人參多糖的提取。

本研究以超臨界脫脂脫皂苷后的人 參渣為原料，采用超臨界輔助熱水浸提法提取人參多糖，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法分析人參多糖的單糖組成和平均分子質量。通過與傳統熱水浸提法進行對比，篩選出一種人參多糖提取率與有效成分含量均相對較高的方法，為實現人參加工副產物的綜合利用以及人參多糖的研究和開發利用提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

超臨界脫脂脫皂苷后的人參渣 實驗室自制；CO2（含量為99.9%，食品級） 長春氧氣廠；乙腈（色譜純） 美國Fisher Scientific公司；L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、D-半乳糖標準品德國Dr.Ehrenstorfer公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HA121-50-02超臨界萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；GB1302電子精密天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FZ102微型植物粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；600 HPLC儀（配有蒸發光檢測器（ELSD 2000ES））、515 HPLC儀（配有410示差折光檢測器） 美國Waters公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京市中興偉業儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 超臨界輔助熱水浸提法提取人參多糖

稱取過一定孔徑篩的原料50 g，加入一定比例的水作夾帶劑，混合均勻，裝入2 L萃取釜中。通過往復泵把CO2打入到萃取釜中，使萃取釜中的壓力達到預設值，同時通過循環水系統給萃取釜加熱，使溫度達到預設值，當溫度和壓力達到設定值之后，關閉往復泵，在一定時間內保持萃取釜內的溫度和壓力不變，以便超臨界流體和物料混合均勻，使得多糖成分最大限度地從物料中溶出，即靜態萃取階段。

當達到萃取時間后，取出料筒，將超臨界處理后的原料置于1 L燒杯中。加入500 mL蒸餾水，100 ℃浸提80 min，間歇攪拌，用0.125 mm（120 目）尼龍布過濾，濾液減壓濃縮至100 mL，加入3 倍體積的95%乙醇溶液，置于4 ℃冰箱中靜置過夜，離心（3 800 r/min， 10 min），收集沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌2 次，然后加適量水溶解，透析，收集透析液，真空干燥，得到白色固體粉末，即為人參多糖固體。稱質量，人參多糖提取率計算見下式：

式中：m1為人參多糖的質量/g；m0為原料的質量/g。

1.3.1.1 單因素試驗

以人參多糖提取率為考察指標，分別對靜態萃取中的萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、夾帶劑用量和物料粒度5 個因素進行單因素試驗。設定萃取壓力為30 MPa、萃取溫度為80 ℃、萃取時間為1.5 h、物料粒度為0.30 mm、原料-夾帶劑比例為1∶2.5（g/mL）。固定其他因素不變，研究某因素對人參多糖提取率的影響。各因素水平為：萃取壓力分別為15、20、25、30 MPa；萃取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃；萃取時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h；原料-夾帶劑比例分別為1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0（g/mL）；物料粒度分別為0.90、0.45、0.30、0.20 mm。

1.3.1.2 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，固定原料-夾帶劑為1∶2.5（g/mL），熱水浸提條件不變，選擇適當的水平對萃取壓力、萃取溫度、萃取時間和物料粒度這4 個因素進行L9（34）正交試驗，確定最佳工藝條件，其因素水平設計如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平表Table1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.2 熱水浸提法提取人參多糖

參考Zhang Xu等[11]的方法，稱取50 g過0.30 mm孔徑篩的超臨界脫脂脫皂苷后人參粉，按料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水，在100 ℃水浴中提取4 h，用120 目尼龍布過濾，如此浸提3 次。合并濾液，繼續方法1.3.1節中的操作，直至得到人參多 糖固體。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 人參多糖純度的測定

采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準繪制標準曲線，于490 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線計算、并經換算因子校正得到人參多糖樣品中的多糖純度，實驗中測得人參多糖的換算因子為f=2.346（n=5）。

1.3.3.2 HPLC測定人參多糖水解產物的單糖組成

（1）色譜條件

色譜柱：Ultimate Diol二醇基柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm 100 ?）；檢測器：蒸發光檢測器（ELSD 2 000 ES）；流動相為乙腈-水（75∶25，V/V）；流速1.0 mL/min；柱溫85 ℃；檢測器溫度35 ℃。

（2）單糖對照品的配制與線性關系考察

精密稱取一定量的L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、D-半乳糖標準品混合，用超純水溶解并定容，得到混標溶液（L-阿拉伯糖0.270 mg/mL、L-鼠李糖0.459 mg/mL、D-葡萄糖0.514 mg/mL、D-甘露糖0.303 mg/mL、D-木糖0.330 mg/mL、D-半乳糖0.223 mg/mL）。分別精密吸取混合標準溶液5、10、15、20、25 μL進樣，測定各單糖對照品的出峰時間，色譜峰面積的對數為縱坐標（Y），以標準品進樣量（μg）的對數為橫坐標（X）繪制標準曲線，計算線性回歸方程（表2）。

表2 單糖標準品的線性回歸方程、相關系數和線性范圍Table2 Linear equations with correlation coeffi cients and linear ranges of six monosaccharides

（3）樣品的制備與測定

取適量人參多糖固體，配制成5%的水溶液，采用Sevag法重復3 次以去除蛋白成分，得到的溶液在200～500 nm波長處進行紫外光譜掃描，發現在260～280 nm波長范圍內沒有蛋白質吸收峰，除蛋白結束。水相合并后減壓濃縮，加入95%乙醇溶液沉淀，收集沉淀，經乙醇洗滌、真空干燥后得脫蛋白后的人參多糖。

精確稱取15 mg脫蛋白后人參多糖，加入2 mL 2 mol/L的三氟乙酸溶液，封管后于100 ℃烘箱中水解10 h。冷卻至室溫，水解液用0.1 mol/L NaHCO3溶液中和至pH 7，真空干燥后，殘渣加入蒸餾水溶解并定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，得供試樣品液，將供試樣品液稀釋50 倍，按照方法1.3.3.2節的色譜條件重復進樣3 次，每次10 μL。

1.3.3.3 HPGPC測定人參多糖的平均分子質量

色譜條件：使用515型HPLC儀，UltrahydrogelTM500色譜柱（7.8 mm×300 mm）和410示差折光檢測器，流動相為0.1 mol/L NaNO3溶液，流速0.5 mL/min，柱溫和檢測器溫度均為35 ℃，進樣量為20 μL。稱取脫蛋白后人參多糖樣品用流動相配成2 mg/mL的溶液，經0.22 μm的濾膜過濾后，用上述的HPLC條件進行分析，記錄色譜圖，采用GPC軟件計算樣品的平均相對分子質量。

1.3.4 數據分析

每組實驗在相同的條件下平行3 次，以降低實驗操作過程所產生的誤差，數據均以±s表示，利用SPSS 16.0方差分析對組間和組內差異進行比較，P＜0.05時為差異顯著，P＜0.01時為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 超臨界輔助熱水浸提法單因素試驗結果

2.1.1 萃取壓力對人參多糖提取率的影響

圖1 萃取壓力對人參多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction pressure on the yield of ginseng polysaccharides

由圖1可知，在萃取壓力為15～30 MPa范圍內，人參多糖的提取率隨著萃取壓力的升高而增大。這是由于壓力的升高可使超臨界流體密度增大，有利于多糖在超臨界流體中的溶解，加快提取速率[12-13]；同時，壓力的增大也會促進基質的溶脹，從而大大加快了有效成分向外擴散的速率，促進萃取過程中的傳質；此外，在較高的萃取壓力下，組織發生形變、疏松，細胞壁被破壞[14]，細胞壁通透性提高，使多糖溶出性增強。由于本試驗設置的最大允許壓力為30 MPa，所以選擇萃取壓力為30 MPa。

2.1.2 萃取溫度對人參多糖提取率的影響

圖2 萃取溫度對人參多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on yield of ginseng polysaccharides

由圖2可知，當萃取溫度小于80 ℃時，隨著萃取溫度的升高，人參多糖的提取率呈現上升的趨勢，這是由于萃取溫度的升高會使溶質的飽和蒸汽壓升高，多糖溶解度增大。此外，萃取溫度對植物細胞的結構也有一定影響，在較高的萃取溫度條件下，植物細胞會發生膨脹、軟化，細胞壁的硬度降低，孔徑增大，使其中的多糖更容易被提取出來[15]；而高于80 ℃時，提取率隨著萃取溫度的上升而下降，這是因為溫度升高導致超臨界流體密度的降低占據了主導地位，溶解能力下降[16-17]。因此，選擇萃取溫度為80 ℃。

2.1.3 萃取時間對人參多糖提取率的影響

圖3 萃取時間對人參多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of ginseng polysaccharides

由圖3可知，隨著萃取時間的延長，人參多糖的提取率呈逐漸增加的趨勢，當萃取時間超過2.0 h時，繼續延長萃取時間，提取率增加不顯著。這是由于隨著時間的延長，物料與超臨界流體和夾帶劑的接觸時間延長，人參多糖可以充分地溶出[18]。而萃取時間超過2.0 h時，由于超臨界流體和夾帶劑已能完全滲入到基質當中，多糖充分溶出，故提取率增加不大。而萃取時間過長也會造成生產周期增長、耗能增加，因此綜合考慮，選擇萃取時間為2.0 h。

2.1.4 夾帶劑用量對人參多糖提取率的影響

圖4 原料與夾帶劑比例對人參多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of material to entrainer on the yield of ginseng polysaccharides

由圖4可知，人參多糖提取率隨著夾帶劑用量的增加而增加；當原料-夾帶劑比例為1∶2.5（g/mL）時，人參多糖提取率達到最高，表明采用水作為夾帶劑有利于人參多糖的提取。這是因為水既對多糖有較好的溶解性，又對基質具有較好的溶脹作用，使物料結構疏松，多糖的溶出阻力降低[19-20]。此外，加入水也會增大超臨界流體的極性，提高對溶質的溶解性及選擇性。繼續增加夾帶劑用量時，多糖提取率顯著變化，且夾帶劑用量過大會在裝料中易發生液體溢出現象[21]，因此，選擇原料-夾帶劑比例為1∶2.5（g/mL）。

2.1.5 物料粒度對人參多糖提取率的影響

圖5 物料粒度對人參多糖提取率的影響Fig.5 Effect of raw material particle size on the yield of ginseng polysaccharides

由圖5可知，物料粒度大于0.3 mm時，人參多糖提取率隨著粒度的減小而顯著提高；物料粒度小于0.3 mm時，提取率隨著粒度的減小增加不明顯。這是因為物料粒度越小，多糖與超臨界流體和夾帶劑的接觸面積大幅度增加，縮短了多糖從物料內部擴散到流體相的路徑，減小了內部擴散阻力。但粒度過細不僅會增加物料加工的難度，而且由于原料粒度過細可能會使超臨界萃取設備的管道發生堵塞，降低多糖的萃取提取率。因此，最佳的物料粒度選用0.3 mm。

2.2 正交試驗設計及結果

表3 L9（34）正交試驗結果Table3 Results of L9(34) orthogonal array design and range analysis

表4 正交試驗方差分析結果Table4 Results of analysis of variance for orthogonal array design

根據表3中的R值可以得出，各因素對人參多糖提取率的影響程度依次為A＞D＞B＞C，即萃取壓力的影響最大，次之為物料粒度，再次為萃取溫度和萃取時間。由表4的方差分析結果可知，萃取壓力和物料粒度對提取率的影響達到極顯著水平（P＜0.01），而萃取溫度和萃取時間對提取率影響不顯著（P＞0.05），這一結果與極差分析結果一致。最優方案為A3B2C1D3，即萃取壓力30 MPa、萃取溫度80 ℃、萃取時間1.5 h、物料粒度0.20 mm。在此條件下人參多糖的提取率為（38.03±1.43）%。

2.3 提取方法的比較

2.3.1 不同提取方法對人參多糖提取率及多糖純度的影響

分別采用超臨界輔助熱水浸提法的最優工 藝以及熱水浸提法提取人參多糖，計算提取率，并對 獲得的人參多糖進行多糖純度的測定，結果如表5所示。超臨界輔助熱水浸提法的人參多糖的提取率和純度比熱水浸提法分別高16.15%和13.44%，并且差異顯著（P＜0.05）。提取時間方面，超臨界輔助熱水浸提法僅用了熱水浸提法的1/4左右。這是由于超臨界流體具有較高的溶解能力和擴散性能，可以 和物料充分接觸，有利于提取的高效性和強選擇性。而且超臨界流體的穿透作用可使細胞壁脆性增強，通透性提高，有利于人參多糖的溶出性和分散性，因而能有效提高提取率[22]。

表5 不同提取方法對人參多糖提取率和多糖純度的影響Table5 Effects of different extraction methods on the yield and purity of ginseng polysaccharides

2.3.2 HPLC分析不同提取方法對人參多糖水解產物中單糖組成的 影響

利用HPLC技術對超臨界輔助熱水浸提法和熱水浸提法提取的人參多糖酸水解液進行分析研究，單糖標準液色譜圖見圖6，兩種方法的多糖水解產物的HPLC圖見圖7，單糖含量的分析結果如表6所示。

圖6 混合標準單糖色譜圖Fig.6 Chromatograms of mixed monosaccharide standards

圖7 超臨界輔助熱水浸提法（A）和熱水浸提法（B）提取人參多糖的單糖組成色譜圖Fig.7 Chromatograms of monosaccharide composition of ginseng polysaccharides extracted by supercritical fl uid assisted hot water extraction (A) and hot water extraction (B)

表6 HPLC測定結果Table6 Monosaccharide composition of ginseng polysaccharides determined by HPLC %

由表6可 以看出，采用超臨界輔助熱水浸提法和熱水浸提法提取的人參多糖的單糖組成相似，均含有較多的葡萄糖，以及少量的半乳糖、阿拉伯糖，表明這兩種方法提取的人參多糖主要由淀粉樣葡聚糖和果膠成 分構成。研究[6]表明，人參淀粉樣葡聚糖和人參果膠具有免疫調節、抗腫瘤以及降血糖等功效，是人參多糖中的重要活性成分。此外，超臨界輔助熱水浸提法中葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量（質量分數）均顯著高于熱水浸提法（P＜0.05）。由此可見，超臨界輔助熱水浸提法不僅省時、高效，而且能一定程度上提高了活性成分的提取率。

2.3.3 HPGPC分析不同提取方法對人參多糖平均分子質量的影響

圖8 超臨界輔助熱水浸提法（A）和熱水浸提法（B）提取人參多糖的GPC 色譜圖Fig.8 GPC chromatogram of ginseng polysaccharides extracted by supercritical fluid assisted hot water extraction (A) and hot water extraction (B)

表7 GPC測定結果Table7 Results of GPC analysis

如圖8所示，超臨界輔助熱水浸提法和熱水浸提法提取的人參多糖GPC色譜峰均分布較寬，對稱性差，說明這2 種方法提取的人參多糖均由多種多糖混合而成。如表7所示，超臨界輔助熱水浸提法提取的人參多糖的峰位分子質量（Mp）從左到右依次為119 015、76 702、 64 792、47 363、28 595、3 215 u，通過GPC軟件計算得到其重均分子質量（Mw）為123 847 u，數均分子質量（Mn）為67 960 u，多分散性1.82；熱水浸提法提取的人參多糖的峰位分子質量（Mp）從左到右依次為115 403、63 107 u，通過GPC軟件計算得到其重均分子質量（Mw）為127 016 u，數均分子質量（Mn）為85 482 u，多分散性1.48。對比2 種提取方法可以看出，超臨界輔助熱水浸提法提取的人參多糖的Mw、Mn都小于熱水浸提法，這可能是由于超臨界輔助熱水浸提過程中，人參多糖在高溫、高壓的作用下發生了降解。而超臨界輔助熱水浸提法提取的人參多糖的多分散性大于熱水浸提法，表明超臨界輔助熱水浸提法提取的人參多糖GPC色譜峰分布比后者更寬，該法提取的人參多糖中所含的多糖種類比后者多，這是由于超臨界流體具有較高的溶解能力和穿透作用，有利于充分溶出細胞壁內的人參多糖。

3 結 論

本研究首次將超臨界萃取技術應用于人參多糖的提取工藝中，采用超臨界靜態萃取技術處理超臨界脫脂脫皂苷后的人參渣，得到的物料再用熱水浸提。研究了靜態萃取中萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、夾帶劑用量和物料粒度5 個因素對提取工藝的影響，并通過正交試驗優化得出了超臨界萃取的最佳工藝參數為：萃取壓力30 MPa、萃取溫度80 ℃、萃取時間1.5 h、原料-夾帶劑比例（g/mL）1∶2.5、物料粒度0.20 mm。此工藝條件下所得的人參多糖提取率為（38.03±1.43）%，多糖純度為（54.71±2.16）%，與熱水提取法相比，提取率和純度分別提高了16.15%和13.44%，而在時間上，超臨界輔助熱水浸提法僅用了熱水浸提法的1/4左右。HPLC測定結果顯示，超臨界輔助熱水浸提取法的人參多糖中葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的含量均顯著高于熱水浸提法。HPGPC測定結果顯示，超臨界輔助熱水浸提法提取的人參多糖的重均分子質量、數均分子質量都小于熱水浸提法，但是超臨界輔助熱水浸提法提取的人參多糖中所含的多糖種類比熱水浸提法多。

本研究所采用的超臨界輔助熱水浸提法和熱水浸提法相比較，在提取時間和多糖提取率上具有顯著的優勢，克服了傳統工藝提取時間長、重復過程多、水資源消耗大、提取效率低的缺點，而且多糖中有效成分的提取率也有一定程度的提高，表明超臨界輔助熱水浸提法是一種快速高效的新型提取方法，對人參多糖的工業生產應用具有一定的參考意義。

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Optimization of Extraction Process of Ginseng Polysaccharides and Monosaccharide Composition Analysis

ZHANG Yanrong, FAN Hongxiu, LIU Hongcheng, ZHANG Ying, WANG Dawei*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Ginseng roots were defatted by supercritical fl uid extraction, treated to remove ginsenosides and extracted by a supercritical fl uid assisted hot water extraction method to obtain gin seng polysaccharides. The optimal c onditions for the extraction of ginseng polysaccharides were determined by orthogonal array experiments. The results showed that when the extraction process was conducted on sampl es pulverized to a particle size of 0.20 mm at 80 ℃ and 30 MPa for 1.5 h with a raw material to entrainer of 1:2.5 (g/mL), the yield and purity of ginseng polysaccharides were (38.03 ± 1.43)% and (54.71 ± 2.16)%, respectively, increased by 16.15% and 13.44% compared to those obtained with the traditional hot water ext raction method, respectively. Monosaccharide composition and mean molecular mass of ginseng polysaccharides were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and high performance gel permeation chromatography (HPGPC). The results showed that there were a large quantity of glucose and small quantities of galactose and arabinose. Th e contents of the three monosaccharides obtained with supercritical fl uid assisted hot water extraction were signifi cantly higher than those obtained wi th hot water ex traction. The average m olecular mass of ginseng polysaccharides extracted by supercritical fl uid assisted hot water extraction and hot water extraction were 123 847 and 127 016 u, respectively. More polysaccharide species in ginseng roots were extracted by supercritical fl uid assisted hot water extraction than by hot water extraction.

supercritical fl uid assisted hot water extraction; ginseng polysaccharides; compositional analysis

TS201.1

A

1002-6630（2015）20-0037-06

10.7506/spkx1002-6630-201520007

2015-04-24

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目（吉教科合字2013第53號）；長春市科技計劃項目（長科技合2013183,13NK12）

張艷榮（1965—），女，教授，博士，研究方向為糧食、油脂與植物蛋白工程。E-mail：xcpyfzx@163.com

*通信作者：王大為（1960—），男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂與植物蛋白工程。E-mail：xcpyfzx@163.com