cyclin D1表達對cN2口腔鱗癌患者TPF誘導化療的預測性研究*

孫文文 唐曉 朱東旺 馬捷 馬海龍 劉瑩 談亦然涂瑤瑤 王麗珍 李江 鐘來平 張陳平 張志愿

·臨床研究與應用·

cyclin D1表達對cN2口腔鱗癌患者TPF誘導化療的預測性研究*

孫文文①唐曉①朱東旺①馬捷①馬海龍①劉瑩①談亦然①涂瑤瑤①王麗珍②李江②鐘來平①張陳平①張志愿①

目的：探討cyclin D1在局部晚期口腔鱗癌患者中預后價值以及能否作為多西他賽聯合順鉑、5-氟尿嘧啶（TPF）誘導化療的預測生物標志物。方法：2008年3月至2010年12月上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院局部晚期口腔鱗狀細胞癌患者256例行TPF誘導化療的前瞻性隨機臨床試驗為研究對象。隨機分為試驗組（術前TPF誘導化療+手術+術后放療）和對照組（手術+術后放療）。采用免疫組織化學法檢測患者活檢標本中cyclin D1蛋白的表達情況，分析cyclin D1表達與行TPF誘導化療患者預后的關系。結果：256例患者中232例符合cyclin D1檢測條件，其中cyclin D1低表達者比高表達者有較高的總生存率（P= 0.001）、無病生存率（P=0.003）、無局部復發生存率（P=0.004）和無遠處轉移生存率（P=0.001）。試驗組和對照組之間的患者預后無差異，cyclin D1表達水平與患者行TPF誘導化療后的療效無顯著相關性，但cN2患者中cyclin D1高表達者可從TPF誘導化療在總生存率（P=0.024）和無遠處轉移生存率（P=0.024）中獲益。結論：cyclin D1可作為局部晚期口腔鱗癌患者的預后生物標志物，cyclin D1高表達的cN2口腔鱗癌患者可從TPF誘導化療中獲益。

口腔鱗狀細胞癌 cyclin D1 誘導化療 生物標志物

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，預后較差，5年生存率僅50%～60%［1-2］，而臨床晚期患者5年生存率更低［3］。目前局部可切除的晚期口腔鱗狀細胞癌患者主要是以根治性手術為主的綜合治療。誘導化療（induction chemotherapy）的主要目的是縮小腫瘤的局部范圍或降低腫瘤的惡性程度，從而最大程度保存正常組織器官、降低腫瘤局部復發或者遠處轉移的風險，提高患者的治療效果［4］。本課題組前期完成了一項探討TPF誘導化療在局部晚期可切除的口腔鱗癌患者的效果的前瞻性隨機臨床對照試驗［5］。雖然臨床結果表明多西他賽聯合順鉑、5-氟尿嘧啶（TPF）誘導化療不能整體提高口腔鱗狀細胞癌患者的生存率，但為開展生物標志物的臨床研究提供了良好的機會。

cyclin D1基因是位于11q13染色體上的原癌基因，通過編碼核蛋白cyclin D1，促進細胞進入細胞周期［6］。以往研究均發現cyclin D1在OSCC患者中高表達，但cyclin D1高表達在口腔鱗癌患者的預后中的預測價值仍存在爭議［7-9］。本研究旨在探討cyclin D1在局部晚期口腔鱗癌患者中的預后價值，以及與TPF誘導化療的關系。

1 材料與方法

1.1 資料

患者256例來自上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院的一項前瞻性隨機對照Ⅲ期臨床試驗（注冊號NCT01542931），其目的在于探討局部晚期口腔鱗癌術前TPF誘導化療方案能否延長患者的生存期。納入標準：臨床Ⅲ/ⅣA期的原發性可切除口腔鱗癌患者，KSP評分＞60，無血液系統、肝臟和腎臟的功能障礙。符合標準的患者隨機分為試驗組（術前TPF誘導化療+手術+術后放療）和對照組（手術+術后放療）。TPF誘導化療方案：第1天靜脈滴注多西他賽75 mg/m2，順鉑75 mg/m2，連續5天靜脈滴注5-氟尿嘧啶750 mg/m2，3個星期為1個療程，共2個療程。誘導化療結束后至少2周行局部的根治性手術，術后4～6周行放療，1.8～2.0 Gy/次，每周5次，共行6周，總放射劑量為54～60 Gy，對具有高危因素的患者，推薦總劑量可達66 Gy。患者治療后2年內隨訪1次/3個月，第3～5年隨訪1次/半年，5年后隨訪1次/年。本研究符合本院倫理委員會要求。

1.2 免疫組織化學染色檢測cyclin D1表達

收集入組患者活檢石蠟標本，檢測cyclin D1表達水平，若對照組活檢標本缺失，則使用手術切除的組織標本替代。免疫組織化學法采用如下常規操作：標本切片厚度為4 μm，于載玻片上經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化去除內源性過氧化物酶，在0.01 M（pH=6.0）檸檬酸鈉緩沖液中煮沸20 min，室溫下冷卻，使用PBS洗滌3次，每次5 min，一抗采用兔源cyclin D1單克隆抗體（購自美國Epitomics公司）按1:150稀釋后4℃下孵育過夜，室溫放置1 h后使用PBS洗滌3次，每次5 min。采用鼠抗兔二抗和DAB試劑盒顯影。PBS替代一抗作為陰性對照。染色結果由2位病理科醫生獨立評價，cyclin D1為細胞核染色。按照陽性細胞占腫瘤細胞的比例進行評分：陽性細胞≤10%為陰性，陽性細胞＜50%為弱陽性，陽性細胞≥50%為強陽性。染色結果強陽性定義為cyclin D1高表達，弱陽性和陰性定義為cyclin D1低表達。1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件包進行統計學分析。生存分析采用Kaplan-Meier方法和Log rank檢驗。患者生存時間從患者入組開始計算，總生存率（overall sur?vival，OS）為患者任何原因的死亡，無病生存率（dis?ease free survival，DFS）為患者腫瘤復發或任何原因的死亡，無局部復發生存率（locoregional recurrence free survival，LRFS）為腫瘤局部或頸部復發或任何原因的死亡，無遠處轉移生存率（distant metastasis free survival，DMFS）為腫瘤遠處轉移或任何原因的死亡。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 局部晚期口腔鱗癌患者cyclin D1表達水平與基線特征的關系

256例患者中24例因活檢或手術標本無法獲取，最終232例用于cyclin D1分析，其中對照組127例、試驗組105例。中位隨訪時間為60個月，所有患者的基線資料和cyclin D1在活檢腫瘤組織中表達水平見表1，cyclin D1低表達155例（對照組84例、試驗組71例），其中陰性37例（對照組19例、試驗組18例）、弱陽性118例（對照組65例、試驗組53例）。cyclin D1高表達77例（對照組43例、試驗組34例）。cyclin D1表達水平在試驗組和對照組中無顯著性差異（χ2=0.215，P=0.898）。cyclin D1表達水平與患者的年齡、性別、臨床分期、病理分級等均無顯著性差異。經5年隨訪，試驗組和對照組的患者OS（P=0.354）、DFS（P=0.162）、LRFS（P=0.392）或DMFS（P=0.207）均無顯著性差異。

表1 局部晚期口腔鱗患者的基線資料和活檢組織中cyclin D1表達情況Table 1 Baseline characteristics of patients with locally advanced oral squamous cell carcinoma and cyclin D1 expression

2.2 cyclin D1表達水平與患者預后的關系

232例患者活檢組織中cyclin D1表達水平與預后顯著相關，cyclin D1低表達的患者與高表達的患者相比其OS（P=0.001）、DFS（P=0.003）、LRFS（P=0.004）和DMFS（P=0.001）具有顯著性差異（圖1）。

2.3 cyclin D1表達水平與TPF誘導化療的預后關系

依據RECIST1.0標準評估試驗組105例患者的短期臨床療效，78.1%（82/105）患者臨床有效（4例完全緩解、78例部分緩解），18.1%（19/105）患者無臨床療效（18例穩定、1例進展），4例患者的臨床療效無法評估。cyclin D1表達水平與TPF誘導化療后臨床療效無明顯相關性（χ2=2.297，P=0.130）。

2.4 cN2患者cyclin D1表達與TPF誘導化療的預后關系

通過對各個亞組分析，發現在臨床頸淋巴結cN2期的患者中，cyclin D1高表達患者在OS（圖2A）和DMFS（圖2B）上可從TPF誘導化療中顯著獲益，而cyclin D1低表達不能顯著獲益（圖2C，2D）。表明cy?clin D1高表達的cN2口腔鱗癌患者可從TPF誘導化療中顯著獲益。

圖1 cyclin D1表達與局部晚期口腔鱗癌患者的預后關系Figure 1 The survival analysis of patients with oral squamous cell carcinoma according to the expression of cyclin D1

圖2 cN2口腔鱗癌患者中cyclin D1不同表達水平與TPF誘導化療的預后關系Figure 2 Survival analysis in cN2patients with oral squamous cell carcinoma based on cyclin D1 expression

3 討論

cyclin D1在G1期與CK4/CK6形成復合物，通過Rb蛋白的磷酸化驅使細胞由G1期進入S期［6］，從而促進細胞增殖。研究發現，在口腔鱗癌中cyclin D1過表達和cyclin D1基因擴增與口腔鱗癌患者的預后不良有關［10］。但也有研究表明cyclin D1基因擴增與口腔鱗癌患者的預后無顯著相關［11］。其原因可能是cy?clin D1的表達上調是通過一定的分子機制增加其翻譯或者受損蛋白的降解，而不是通過cyclin D1基因的擴增變異調節［12］。同時也有研究表明cyclin D1的表達和口腔鱗癌患者的預后無明顯相關性［8］。在對cyclin D1表達的研究基礎上，將cyclin D1蛋白的表達水平作為一種潛在的預測患者預后的分子標志物。本研究將cyclin D1作為潛在的生物標志物探索局部晚期口腔鱗癌患者能否從TPF誘導化療中獲益，發現患者在cyclin D1低表達中治療效果明顯好于cyclin D1高表達，同時cyclin D1高表達的cN2患者可從TPF誘導化療中獲益，說明cyclin D1不僅可以作為口腔鱗癌的預后生物標志物，也可以作為cN2患者接受TPF誘導化療的預測性生物標志物。

本研究在對試驗組的患者行化療療效分析中，發現cyclin D1蛋白作為生物標志物預測患者的化療療效時具有一定的局限性。通過亞組分析，發現cN2期患者中cyclin D1高表達的患者接受TPF誘導化療后有較高的總生存率和無遠處轉移生存率，而cyclin D1低表達的患者不能從TPF誘導化療中獲益。當然，這一結果還需要新的臨床試驗加以驗證。可利用cyclin D1作為一項活檢病理指標在cN2口腔鱗癌患者中行手術前篩查，對于cyclin D1高表達的患者行TPF誘導化療的臨床試驗，而對于cyclin D1低表達的患者建議直接手術和術后放射治療，以期整體提高患者的療效，同時降低醫療成本。

根據多項頭頸鱗癌患者的誘導化療Meta分析發現，誘導化療能明顯降低患者的5年遠處轉移率，降低遠處轉移的風險［13-15］。本課題組前期的口腔鱗癌TPF誘導化療臨床試驗發現，誘導化療降低遠處轉移率的效果不是很顯著［16］，但如結合cyclin D1作為預測性生物標志物，cN2口腔鱗癌患者可以從TPF誘導化療中顯著獲益，無遠處轉移生存率較對照組顯著提高。因此，對于cN2期口腔鱗癌患者，采用生物標志物篩選，對提高療效具有十分重要的意義。

綜上所述，cyclin D1高表達可以作為預測局部晚期口腔鱗癌患者的預后不良生物標志物，同時也可以作為cN2患者接受TPF誘導化療的預測性生物標志物。

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（2015-06-19收稿）

（2015-08-18修回）

鐘來平 專業方向為口腔頜面部腫瘤的臨床與基礎研究。

E-mail：zhonglaiping@163.com

“國家基金研究進展綜述”欄目介紹

《中國腫瘤臨床》為突出辦刊宗旨與特色，快速報道我國當前腫瘤學領域的最新進展與科研發展動向，于2014年開辟“國家基金研究進展綜述”欄目,旨在介紹國家級基金資助項目的研究目的、創新性、意義、現狀與展望。文章撰寫可選取基金標書中的立項依據、研究內容、研究目標、項目特色與創新之處等重要內容。來稿一經錄用實行在線優先發表，2個月內見刊。歡迎廣大腫瘤學醫師與基礎研究人員投稿，借助此欄目展示其學術觀點與研究進展。

——《中國腫瘤臨床》編輯部

Cyclin D1 as a potential predictive biomarker for TPF induction chemotherapy in cN2patients with oral squamous cell carcinoma

Wenwen SUN1,Xiao TANG1,Dongwang ZHU1,Jie MA1,Hailong MA1,Ying LIU1,Yiran TAN1,Yaoyao TU1,Lizhen WANG2,Jiang LI2,Laiping ZHONG1,Chenping ZHANG1,Zhiyuan ZHANG1

1Department of Oral Maxillofacial and Head and Neck Oncology,2Department of Oral Pathology,Shanghai Ninth People's Hospital,School of Stomatology,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200011,China
This work was supported by the Shanghai Municipal Foundation of Talents Development(No.201447)

Objective:To investigate the potential prognostic value of cyclin D1 expression in patients with locally advanced oral squamous cell carcinoma(OSCC)and its relationship with taxol(Docetaxel)/cisplatin plus 5-fluorouracil(TPF)induction chemotherapy.Methods:A total of 256 patients with locally advanced OSCC were selected from Shanghai Ninth People's Hospital of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine between March 2008 and December 2010 as the objects of study in this prospective randomized clinical trial.The effect of TPF induction chemotherapy was investigated.Immunohistochemical staining against cyclin D1 was performed in the pretreatment biopsy specimen of the patients.The relationship between cyclin D1 expression and prognostic data of the TPF induction arm and control arm was analyzed.Results:Cyclin D1 expression was detected in 232 out of the 256 patients.Patients with low cyclin D1 expression showed significantly better overall survival(OS)(P=0.001),disease-free survival(DFS)(P=0.003),locoregional recurrence-free survival(LRFS)(P=0.004),and distant metastasis-free survival(DMFS)(P=0.001)than those with high cyclin D1 expression.No significant differences existed in OS,DFS,LRFS,or DMFS between the patients with TPF induction chemotherapy and the control.Cyclin D1 expression levels were not predictive of the benefit from TPF induction chemotherapy in the overall population.However,patients with nodal stage cN2and high cyclin D1 expression,who were undergoing TPF chemotherapeutic regimen, showed significantly higher OS(P=0.024)and DMFS(P=0.024)than cN2patients with high cyclin D1 expression but undergoing standard surgical treatment.Conclusion:Cyclin D1 can be used as a prognostic biomarker for patients with locally advanced OSCC.Furthermore,cN2OSCC patients with high cyclin D1 expression can receive long-term benefit from the addition of TPF induction chemo-therapy to standard surgical treatment.

oral squamous cell carcinoma,cyclin D1,induction chemotherapy,biomarker

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.16.867

①上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面-頭頸腫瘤科，上海市口腔醫學重點實驗室（上海市200011）；②口腔病理科

*本文課題受上海市人才發展資金（編號：201447）資助

鐘來平 zhonglaiping@163.com