可控酶法制備河蜆抗氧化肽工藝優化

劉晶晶 金林烽 韓曜平 王雪鋒 戴陽軍

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

生物活性肽分布很廣泛，人們已從各種食品原料中鑒定出具有不同功能的生物活性肽（如抗氧化、抑菌、抗癌、改善免疫調節、提高人體耐力），使得對肽的研究日趨升溫［1］。其中，對抗氧化肽的研究更是炙手可熱，近年來，已從水產蛋白（鱗魚、鯖魚、巨魷魚皮、白蝦頭和黃鰭金槍魚骨架蛋白）中提取了具有顯著抗氧化活性的肽段［2］。

河蜆（Corbicula fluminea），又稱黃蜆、金蚶、扁螺等，廣泛分布于中國內陸水域，是中國重要的經濟貝類之一。河蜆含有豐富的蛋白質、糖原、必需氨基酸、牛磺酸、多種維生素以及鈣、磷、鐵、硒等具有特殊生理作用的礦物質［3］。由于河蜆所具有的營養、藥用及食療價值，對河蜆的開發研究越來越受到國內外專家和學者的關注。邱春江等［4］研究發現花蜆的酶解物具有較強的清除羥自由基能力。劉杰等［5］研究發現河蜆的酶解液具有顯著的清除超氧陰離子自由基和羥自由基作用。張磊等［6］發現河蜆提取物可能對酒精性肝損傷有保護作用。吳立峰等［7］報道河蜆糖蛋白對小鼠化學性肝損傷有保護作用。王一錚等［8］研究發現河蜆湯對小鼠急性乙醇肝損傷的保護作用。J.S.Tsai等［9］研究發現河蜆肌肉蛋白水解物對血管緊張素Ⅰ轉換酶具有一定的抑制作用。可見，目前河蜆的研究主要集中于提取物和酶解液在抗氧化、護肝及降血壓等功效方面的研究，而對河蜆抗氧化肽的可控酶解制備方面的研究未見報道。本試驗擬采用可控酶解法制備河蜆抗氧化肽，旨為開發新型抗氧化劑、抗衰老功能食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

速凍河蜆肉：江蘇省宿遷楠景水產品有限公司；

堿性蛋白酶（酶活2.0×105U/g）、中性蛋白酶（酶活2.0×105U/g）、木瓜蛋白酶（酶活8.0×105U/g）、復合風味蛋白酶（酶活1.5×104U/g）和菠蘿蛋白酶（酶活6.0×105U/g）：分析純，上海奧宇生物科技有限司公司；

氫氧化鈉、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和H2O2：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：EL104型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

冰箱：BCD－216TDXZA型，青島海爾股份有限公司；

分光光度計：722型，上海菁華科技儀器有限公司；

離心機：80－2型，金壇市榮華儀器制造有限公司；

水浴鍋：HHS－11－2型，江蘇金壇宏凱儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

（1）酶種類的篩選：將河蜆肉流水解凍，按1∶3（m∶V）的料液比加水后用組織搗碎機勻漿，分別添加0.75%的不同種類蛋白酶，在各自最適的溫度和pH條件下（見表1）水解4h，100℃滅酶20min，4 000r/min離心30min，取上清液測定羥自由基清除率并進行比較，從而篩選合適的蛋白酶。

表1 不同蛋白酶最適酶解條件Table 1 The optimum hydrolysis conditions of proteases

（2）料液比對羥自由基清除率的影響：將河蜆肉流水解凍，按照不同料液比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，m∶V）勻漿，分別加入0.75%的中性蛋白酶，調節pH為7.0，于48℃的恒溫水浴鍋中酶解4h，100℃滅酶20min，4 000r/min離心30min，得到不同料液比的河蜆抗氧化肽，取上清液測定羥自由基清除率并進行比較，從而篩選合適的料液比。

（3）pH對羥自由基清除率的影響：將河蜆肉流水解凍，按照料液比1∶2（m∶V）進行勻漿，調節不同pH（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0），分別加入0.75%的中性蛋白酶，于48℃的恒溫水浴鍋中酶解4h，100℃滅酶20min，4 000r/min離心30min，得到不同pH條件的河蜆抗氧化肽，取上清液測定羥自由基清除率并進行比較，從而篩選合適的pH。

（4）加酶量對羥自由基清除率的影響：將河蜆肉流水解凍，按照料液比1∶2（m∶V）進行勻漿，加入不同比例的中性蛋白酶（0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%），調節 pH為6.5，于48℃的恒溫水浴鍋中酶解4h，100℃滅酶20min，4 000r/min離心30min，得到不同加酶量的河蜆抗氧化肽，取上清液測定羥自由基清除率并進行比較，從而篩選合適的加酶量。

（5）酶解溫度對羥自由基清除率的影響：將河蜆肉流水解凍，按照料液比1∶2（m∶V）進行勻漿，調節pH為6.5，再加入0.75%的中性蛋白水解酶，于不同溫度（28，38，48，58，68℃）下酶解4h，100 ℃滅酶20min，4 000r/min離心30min，得到不同水解溫度的河蜆抗氧化肽，取上清液測定羥自由基清除率并進行比較，從而篩選合適的酶解溫度。

（6）酶解時間對羥自由基清除率的影響：將河蜆肉流水解凍，按照料液比1∶2（m∶V）進行勻漿，調節pH為6.5，加入0.75%的中性蛋白酶，于48℃的恒溫水浴鍋中分別酶解1，2，3，4，5h，100 ℃滅酶20min，4 000r/min離心30min，得到不同酶解時間的河蜆抗氧化肽，取上清液測定羥自由基清除率并進行比較，從而篩選合適的酶解時間。

1.2.2 羥自由基清除率的測定 參照趙謀明等［10］的方法。清除率按式（1）進行計算：

式中：

c——清除率，%；

A1——樣品管在波長536nm處的吸光值；

A2——用去離子水代替樣品液后，在波長536nm處的吸光值；

A3——用去離子水代替樣品液和 H2O2溶液，在波長536nm處的吸光值。

1.2.3 數據統計分析 所有試驗至少3次重復，用 Microsoft Excel進行數據整理，不同平均值之間用SPSS 11.5統計軟件中的鄧肯氏多重比較法（duncan's multiple range test）進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶種類的篩選試驗 由圖1可知，采用5種蛋白酶制備的河蜆抗氧化肽對羥自由基清除率的影響存在顯著性的差異，其中采用菠蘿蛋白酶制備的河蜆抗氧化肽對羥自由基清除率最低，僅有46.00%，而中性蛋白酶制備的河蜆抗氧化肽對羥自由基清除率最高，達70.20%，故本試驗采用中性蛋白酶來制備河蜆抗氧化肽。

圖1 酶種類的篩選試驗結果Figure 1 The results of different protease effect

2.1.2 料液比對羥自由基清除率的影響 由圖2可知，酶解液對羥自由基清除率隨料液比增大而呈下降趨勢，數據經分析得出料液比為1∶1與1∶2（m∶V）的酶解物對羥自由基清除率沒有顯著性差異。而考慮到試驗操作測定的便利性，本試驗采用1∶2（m∶V）的料液比進行試驗。

圖2 料液比對羥自由基清除率的影響Figure 2 Effect of solid－liquid ratio on hydroxyl radical scavenging

2.1.3 pH對羥自由基清除率的影響 由圖3可知，在不同的pH條件下制備的河蜆抗氧化肽對羥自由基清除率具有顯著性差異，在pH為6.0～6.5時，曲線呈上升趨勢，而當pH調節到6.5時其羥自由基清除率可達到最高值79.60%，在pH為6.5～8.0時，曲線又呈下降趨勢，確定中性蛋白酶的最適pH為6.5。

圖3 pH對羥自由基清除率的影響Figure 3 Effect of pH on hydroxyl radical scavenging

2.1.4 加酶量對羥自由基清除率的影響 由圖4可知，羥自由基清除率隨加酶量的增大而升高，因為在底物濃度一定的情況下，蛋白酶的含量越高，其酶解越充分，從而導致酶解制備的抗氧化肽對羥自由基清除率呈上升的趨勢。但當加酶量超過0.75%時，不同加酶量的酶解產物對羥自由基清除率沒有顯著性差異，結合成本考慮，選用添加0.75%的中性蛋白酶。

圖4 加酶量對羥自由基清除率的影響Figure 4 Effect of the amount of enzyme on hydroxyl radical scavenging

2.1.5 酶解溫度對羥自由基清除率的影響 由圖5可知，不同溫度條件下制備的河蜆抗氧化肽對羥自由基清除率存在顯著性差異，其中48℃時抗氧化肽對羥自由基清除率最高，達到了75.00%。因為蛋白酶具有最適反應溫度，在48℃時，中性蛋白酶活性最強，酶解液清除羥自由基的能力最強。低于或高于48℃時，酶活力下降，酶解液清除羥自由基的能力也隨之下降。故選用48℃為河蜆抗氧化肽的最佳酶解溫度。

圖5 酶解溫度對羥自由基清除率的影響Figure 5 Effect of the enzymatic temperature on hydroxyl radical scavenging

2.1.6 酶解時間對羥自由基清除率的影響 由圖6可知，酶解產物對羥自由基清除率隨酶解時間的增加而增大，在酶解時間為1～3h時，羥自由基清除率呈明顯的上升趨勢，而在3h后曲線的上升趨勢明顯緩慢，且酶解時間為3h和4h時，羥自由基清除率沒有顯著性差異。這是由于酶解初期，酶量充足，酶解速度較快，酶解液中抗氧化肽含量上升較快；一定時間后，酶解速度緩慢，且隨著水解時間的延長，抗氧化肽含量增加不明顯，故酶解時間選用3h為宜。

圖6 酶解時間對羥自由基清除率的影響Figure 6 Effect of hydrolysis time on hydroxyl radical scavenging

2.2 響應面試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用Design－Expert 7.1.3軟件中的Box－Behnken試驗設計原理［11，12］，固定料液比為1∶2（m∶V），選取對河蜆酶解工藝具有顯著影響的因素：酶解溫度、pH、酶解時間和加酶量進行4因素3水平的試驗設計，各因素水平編碼表見表2，試驗結果見表3。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and level of experiment by response surface

表3 響應面試驗結果Table 3 Experimental results of response surface

2.2.1 方差分析 使用軟件對結果進行分析處理，得到結果見表4。

表4 回歸方程顯著性檢驗和方差分析Table 4 Analysis of variance and significance test of regression equation

表4 回歸方程顯著性檢驗和方差分析Table 4 Analysis of variance and significance test of regression equation

＊＊表示極其顯著，P＜0.001；＊表示顯著，P＜0.05。

來源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 顯著性模型 0.07 14 5.03E－03 5.20 0.000 2 ＊＊A 0.021 1 0.021 21.97 0.000 3 ＊＊B 1.20E－03 1 1.20E－03 1.24 0.284 1 C 4.14E－03 1 4.14E－03 4.28 0.057 4 D 0.02 1 0.02 20.86 0.000 4 ＊＊AB 1.96E－04 1 1.96E－04 0.20 0.659 5 AC 1.85E－03 1 1.85E－03 1.91 0.188 4 AD 3.91E－03 1 3.91E－03 4.04 0.044 2 ＊BC 1.00E－04 1 1.00E－04 0.10 0.752 6 BD 1.94E－03 1 1.94E－03 2.00 0.179 0 CD 7.02E－04 1 7.02E－04 0.73 0.408 5 A2 6.98E－03 1 6.98E－03 7.22 0.017 7 ＊B2 5.47E－04 1 5.47E－04 0.57 0.464 5 C2 2.23E－03 1 2.23E－03 2.31 0.150 8 D2 0.01 1 0.01 10.56 0.005 8 ＊殘差0.014 14 9.67E－04失擬 0.012 10 1.16E－03 2.33 0.215 5誤差 1.99E－03 4 4.96E－04總和0.084 28

表5 去掉不顯著項后的優化結果Table 5 The optimization results of excluding

表5 去掉不顯著項后的優化結果Table 5 The optimization results of excluding

＊＊表示極其顯著，P＜0.001；＊表示顯著，P＜0.05。

來源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 顯著性模型 619.63 6 103.27 10.34 ＜0.000 1 ＊＊A 212.52 1 0.021 21.97 0.000 1 ＊＊C 41.44 1 41.44 4.75 0.043 8 ＊D 201.72 1 201.72 20.20 0.000 2 ＊＊AD 39.06 1 39.06 4.43 0.004 5 ＊A2 55.65 1 55.65 5.57 0.027 5 ＊D2 85.86 1 85.86 8.60 0.007 7 ＊殘差219.75 22 9.99失擬 199.90 18 11.11 2.24 0.226 7誤差 19.85 4 4.96總和839.38 28

手動優化后的二次回歸方程為：

手動調整后的變異系數（C.V.%）為4.20，小于5.0，所以整個試驗的模型穩定性較強，試驗設計較為合理。

對結果影響較強的交互項響應曲面圖見圖7。

圖7 酶解溫度與加酶量對羥自由基清除率影響的響應曲面和等高線Figure 7 Response surface plot and contour plot for effects of the amount of enzyme and temperature and their mutual interaction on hydroxyl radical scavenging

由表4可知：模型中F值為5.2，P值為0.002＜0.05，因此回歸方程對羥自由基清除率具有較高顯著性，而且模型中的失擬項P值為0.215 5＞0.05（不顯著）表示該模型是比較穩定的［13］，可以很好地解釋分析響應結果并能正確預測最佳工藝條件。單因素中溫度、加酶量對羥自由基清除率的影響是極其顯著（P＜0.001）；交互因素中溫度與加酶量對羥自由基清除率的影響顯著（P＜0.05）。

2.2.2 回歸模型優化 將不顯著項手動刪除，見表5。

由圖7可知，加酶量與溫度相互作用對羥自由基清除率的影響顯著（P＜0.05），其等高線中心呈較完整的橢圓形，峰值出現在溫度55℃與加酶量0.70%～0.90%，并且當溫度一定時，并非加酶量越多酶解效果越好，因此適量添加蛋白酶不僅能夠達到最優酶解效果，而且工廠化生產后可以節約部分成本。

通過Design－Expert 7.1.3軟件計算分析并預測出最優工藝條件為：溫度54.70℃，pH 6.00，酶解時間3.91h，中性蛋白酶的加酶量為0.94%，理論預測值羥自由基清除率為83.34%。

2.3 驗證實驗

根據Design－Expert 7.1.3軟件計算出的最優工藝條件：料液比為1∶2（m∶V），添加0.94%中性蛋白酶，在pH為6.00，溫度為54.70℃的條件下酶解3.91h，實際測得酶解制備的河蜆抗氧化肽對羥自由基清除率為81.63%，與理論預測值相差1.71%，可見模型預測值在實際值的誤差范圍之內，說明該模型可以用來優化制備河蜆抗氧化肽。

3 結論

（1）在單因素試驗基礎上，通過Box－Behnken試驗設計和響應面分析法，經過分析建立二項數學模型，確定最佳酶解工藝條件為料液比1∶2（m∶V），中性蛋白酶的添加量0.94%，酶解時間3.91h，酶解溫度54.70℃和pH 6.00，模型預測該條件下羥自由基清除率為83.34%，而實際測定值為81.63%，屬于試驗誤差范圍內，因此，利用該模型來優化河蜆抗氧化肽的酶法制備工藝參數準確、可靠，具有實用價值。

（2）利用可控酶解技術對河蜆蛋白進行深度開發，該工藝條件下制備的河蜆抗氧化肽對羥自由基清除率較高，為制備新型抗氧劑和具有抗氧化功效的富肽酶解物并開發系列功能食品提供理論依據，為河蜆的深度加工提供一條新的途徑。

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