響應(yīng)面優(yōu)化L－賴氨酸培養(yǎng)基

滕國生 劉 勇 武麗達(dá) 范春艷 王金枝 關(guān) 兵 史淑輝 佟 毅

（1.吉林中糧生化有限公司，吉林 長春 130012；2.玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 130012；3.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012）

賴氨酸是合成人和動(dòng)物組織蛋白質(zhì)的必需物質(zhì)，是激素、體內(nèi)酶、抗體等重要功能性物質(zhì)的主要成分，人體和動(dòng)物自身不能合成賴氨酸，必須從食物中攝取，而植物中含有的賴氨酸很少，被稱為植物中第一限制性氨基酸［1，2］。國內(nèi)外市場對(duì)賴氨酸的需求都非常大，主要用于飼料生產(chǎn)，約占90%左右，食品添加劑和強(qiáng)化劑占5%左右，還有5%用于醫(yī)藥中間體方面［3］。由25～30個(gè)賴氨酸殘基聚合而成的ε－多聚賴氨酸是一種良好的食品防腐劑［4］。賴氨酸的市場需求迅速增長拉動(dòng)了L－賴氨酸的生產(chǎn)，未來幾年，中國食品工業(yè)賴氨酸的市場需求平均年增長將在10%左右［5］。隨著用賴氨酸生產(chǎn)各種藥物的需求量的增加，中國賴氨酸需求量目前估計(jì)在8萬t/年左右［6］。賴氨酸的生產(chǎn)方法主要有提取法、化學(xué)合成法、酶法、微生物發(fā)酵法［6］。微生物發(fā)酵產(chǎn)生的賴氨酸均為L－型，而生物所能利用的賴氨酸也為L－型。因此，微生物發(fā)酵法是目前工業(yè)生產(chǎn)L－賴氨酸最主要的方法［7］。

玉米漿為生產(chǎn)玉米淀粉的副產(chǎn)物，含有大量的糖類、多肽、生長素、可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸等其他有機(jī)物，是微生物發(fā)酵氨基酸的良好氮源［8－10］。玉米漿中很多成分是發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的前體成分，在氨基酸發(fā)酵中提供氮源和生長因子，玉米中的生物素、限制性氨基酸對(duì)多種氨基酸發(fā)酵的影響都很大［11］。玉米漿價(jià)格低廉，來源豐富，利用玉米漿發(fā)酵氨基酸有利于提高玉米漿的生物價(jià)值，降低工業(yè)生產(chǎn)氨基酸的成本。

響應(yīng)面法是工藝優(yōu)化常用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法［12－14］。Plackett－Burman確定出主次因素。最陡爬坡法能夠快速尋找各變量變化最優(yōu)區(qū)域。這3種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法常用于微生物培養(yǎng)基的優(yōu)化［15－18］。本試驗(yàn)擬運(yùn)用 Design Experts 7.0分析軟件，將Plackett－Burma（PB）方法和響應(yīng)面法應(yīng)用于L－賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化和發(fā)酵工藝關(guān)鍵參數(shù)的篩選，以期進(jìn)一步提高L－賴氨酸產(chǎn)量，降低工業(yè)生產(chǎn)氨基酸的成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

L－賴氨酸棒桿菌株（代號(hào)：ATCC14067）：由吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

KH2PO4、MgSO4·7H2O、蘇氨酸、CaCO3、NH4Cl、NaCl：分析純，北京化工廠。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)：UVMINI－1240型，日本島津株式會(huì)社；

恒溫?fù)u床，SPX－150－Z型，中國上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，玉米漿20g/L，KH2PO40.01%，MgSO4·7H2O 0.01%，CaCO34%，pH 7.0～7.2，0.75kg/cm2滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40g/L，玉米漿40g/L，KH2PO40.02%，NH4Cl 6%，NaCl 1.8%，蘇氨 酸 0.06%，CaCO36%，MgSO4·7H2O 0.02%，pH 7.0～7.2，0.75kg/cm2滅菌20min。

1.2 培養(yǎng)方法

菌株經(jīng)斜面活化后，取一環(huán)接入到含有40mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30℃中以200r/min震蕩培養(yǎng)24h。取5mL培養(yǎng)后溶液接種到含有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30℃以200r/min震蕩培養(yǎng)48h。將發(fā)酵液于8 000r/min下離心10min，取上清液測定其中L－賴氨酸含量。每組相同發(fā)酵培養(yǎng)基平行試驗(yàn)3次，含量取平均值。

1.3 L－賴氨酸含量測定

采用茚三酮比色法［19］測定L－賴氨酸濃度，配制濃度為500μg/L的L－賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL于干凈的具塞比色管中，加水至1.0mL，再加入1.0mL茚三酮試劑，搖勻后塞緊管塞，沸水浴5min后冷卻至室溫，每管再加入50%乙醇8.0mL，于530nm處測定OD值。以L－賴氨酸含量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程為Y＝1.866x＋0.018（R2＝0.999 0）。以樣品代替標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過方程計(jì)算其L－賴氨酸含量。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 Plackett－Burman設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)選取8種培養(yǎng)基成分，選用N＝8的Plackett－Burman設(shè)計(jì)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，設(shè)定每個(gè)因素的高水平約為低水平的2倍，試驗(yàn)12次，響應(yīng)值為L－賴氨酸含量。PB設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 Plackett－Burman設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett－Burman design

1.4.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)PB設(shè)計(jì)的結(jié)果，由各因素效應(yīng)值的大小確定變化的步長。正效應(yīng)取高水平，負(fù)效應(yīng)取低水平。按一定的梯度增加或者減少各因素的水平值，檢測發(fā)酵液中L－賴氨酸含量的變化，含量最高組的水平值即為響應(yīng)面分析的中心組。

1.4.3 響應(yīng)面分析方法 根據(jù)PB設(shè)計(jì)篩選出的3個(gè)顯著因素作為試驗(yàn)因素，根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)篩選出的濃度作為中心點(diǎn)，采用響應(yīng)面中的Box－Behnken設(shè)計(jì)方法。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析 采用Design Expert 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得最優(yōu)組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett－Burman設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

采用Design Expert 7.0軟件對(duì)表2進(jìn)行分析，得到各影響因子的偏回歸系數(shù)及其顯著性結(jié)果，見表3。在8個(gè)因素中，C、E、H因素即 NaCl、MgSO4·7H2O、玉米漿對(duì)L－賴氨酸的得率影響顯著（P＜0.05），故將 NaCl、MgSO4·7H2O、玉米漿確定為主要影響因素，且NaCl、MgSO4·7H2O為正效應(yīng)，玉米漿為負(fù)效應(yīng)。故在下一步試驗(yàn)中，應(yīng)該在NaCl、MgSO4·7H2O的高水平基礎(chǔ)上增加其含量，在玉米漿的低水平基礎(chǔ)上減少其含量。對(duì)于影響不顯著的因素，正效應(yīng)因素與負(fù)效應(yīng)因素分別取＋1水平和－1水平。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果中因素NaCl、MgSO4·7H2O、玉米漿效應(yīng)的大小確定最陡爬坡試驗(yàn)變化的方向和步長。由表4可知，5組試驗(yàn)中，第4組的L－賴氨酸含量最高，故選擇第4組的水平為下一步響應(yīng)面設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，即NaCl 2.6%、MgSO4·7H2O 0.05%、玉米漿19.5%。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

Box－Behnken設(shè)計(jì)因素及水平取值見表5。

通過Design Expert 7.0軟件對(duì)表6數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到回歸方程為：

表2 Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The Plackett－Burman design and results

表3 Plackett－Burman設(shè)計(jì)各因素的偏回歸系數(shù)及其顯著性Table 3 Partial regression coefficients and significance of factors in Plackett－Burman design

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Steepest ascent design and results

表5 Box－Behnken設(shè)計(jì)因素水平表Table 5 Factors and levels of Box－Behnken design

對(duì)此模型進(jìn)行方差分析（表7）可知：擬合度R2＝0.973 7，說明該試驗(yàn)提取得率的試驗(yàn)值與預(yù)測值之間有很好的擬合度；P＜0.01說明該模型極其顯著；失擬量為2.22說明失擬量相對(duì)于純誤差不顯著；信噪比為12.603＞4表明該模型有足夠的信噪比；該模型的F值為20.56，失擬項(xiàng)不顯著。綜上表明，該模型預(yù)測值與試驗(yàn)值的差異很小可用于指導(dǎo)試驗(yàn)。

在此模型中 A、B、AB、A2、B2均顯著，C、AC、BC、C2不顯著，同時(shí)各因素的均方值可以反映出各個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的重要性。均方值越大表明其對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大。從表7的均方值可以看出影響賴氨酸得率因素的主次順序?yàn)椋篈＞B＞C，即NaCl＞MgSO4·7H2O＞玉米漿。

表6 Box－Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 The Box－Behnken design and results

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

“＊”表示差異顯著，P＜0.05；“＊＊”表示差異極顯著，P＜0.01；“—”表示不顯著。

來源 平方和 自由度 均方 F值 Pr＞F 顯著性模型 640.80 9 71.20 20.56 0.002 0 17.32 5 3.46失擬項(xiàng) 13.32 3 4.44 2.22 0.325 2 —純誤差 3.99 2 2.00總誤差＊＊A 101.75 1 101.75 29.38 0.002 9 ＊＊B 41.72 1 41.72 12.05 0.017 8 ＊C 9.03 1 9.03 2.61 0.167 3 —AB 26.94 1 26.94 7.78 0.038 5 ＊AC 2.67 1 2.67 0.77 0.419 8 —BC 1.73 1 1.73 0.50 0.511 4 —A2 392.35 1 392.35 113.29 0.000 1 ＊＊B2 90.96 1 90.96 26.26 0.003 7 ＊＊C2 4.72 1 4.72 1.36 0.295 6 —?dú)埐?58.11 14

各因素交互作用對(duì)L－賴氨酸得率的相應(yīng)曲面和等高線圖見圖1～3。由圖1～3可知，NaCl與MgSO4·7H2O的交互作用顯著。當(dāng)玉米漿的含量一定時(shí)，隨著培養(yǎng)基中NaCl和MgSO4·7H2O含量的增加，L－賴氨酸的得率先逐漸增加后逐漸降低，在 NaCl和 MgSO4·7H2O分別為2.66%，0.04%時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)L－賴氨酸得率為101.32g/L。當(dāng)MgSO4·7H2O含量一定時(shí)，玉米漿與NaCl的交互作用并不顯著；而當(dāng)NaCl含量一定時(shí)，玉米漿與MgSO4·7H2O的交互作用也不顯著。顯示玉米漿的添加量對(duì)L－賴氨酸的得率影響不大，隨著玉米漿含量的增加，L－賴氨酸的得率均略微有所增加，但增加的幅度都不大。

經(jīng)過Design Experts 7.0軟件的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，分析優(yōu)化得到的最佳條件為 NaCl 2.72%，MgSO4·7H2O 0.05%，玉米漿21.13g/L，在此條件下，L－賴氨酸的理論得率為104.75g/L。通過對(duì)此最優(yōu)模型進(jìn)行3次驗(yàn)證，結(jié)果分別為104.52，104.97，104.60g/L，平均值為104.70g/L，與模型的理論值基本符合，說明該模型能夠較好的預(yù)測實(shí)際發(fā)酵中L－賴氨酸的得率。

圖1 NaCl與MgSO4·7H2O交互影響L－賴氨酸得率的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 1 Response surface plot and contour plot of effect of sodium chloride and magnesium sulfate on L－lysine yield

圖2 NaCl與玉米漿交互影響L－賴氨酸得率的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 2 Response surface plot and contour plot of effect of sodium chloride and corn starch on L－lysine yield

圖3 MgSO4·7H2O與玉米漿交互影響L－賴氨酸得率的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 3 Response surface plot and contour plot of effect of magnesium sulfate and corn starch on L－lysine yield

3 結(jié)論

本試驗(yàn)運(yùn)用Design Experts 7.0分析軟件，先通過Plackett－Burman方法和響應(yīng)面法確定了影響L－賴氨酸得率的主要因素為NaCl、MgSO4·7H2O和玉米漿，再通過爬坡試驗(yàn)和Box－Behnken設(shè)計(jì)方法，確定3個(gè)主要因素物質(zhì)的添加量分別為2.72%，0.05%和21.13g/L，理論 L－賴氨酸得率為104.75g/L。經(jīng)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平均值為104.60g/L，與理論值相符。此實(shí)際值與優(yōu)化前的87.93g/L相比，提高了18.96%。因此，利用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化L－賴氨酸棒桿菌株產(chǎn)L－賴氨酸的方法是可行的，同其它微生物發(fā)酵方法相比，此種方法降低了葡萄糖的含量，可以充分利用玉米漿所含營養(yǎng)物質(zhì)，降低生產(chǎn)成本，更適宜工業(yè)生產(chǎn)。

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