杜香多糖的抗氧化活性及物理性質研究

張喬會 王建中 逄錦慧 崔 潔 楊 喆 羅興武

（1.湖北民族學院科技學院，湖北 恩施 445000；2.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083；3.林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083）

杜香（Ledum palustreL.）為杜鵑花科杜香屬的常綠灌木［1］，是中國東北、內蒙古大興安嶺林區(qū)的主要組成樹種，其分布面積約占大興安嶺林地面積的70%［2］。據(jù)統(tǒng)計［3］，大興安嶺杜香干葉年產(chǎn)量達53.6萬t。杜香枝葉成分豐富，含有多種揮發(fā)性精油、熊果酸、多糖等［4，5］。

杜香資源豐富，目前主要研究其精油［6］、熊果酸［7］等，而對杜香多糖的理化性質研究未見報道。隨著保健品市場的活躍，杜香資源開發(fā)潛力巨大，研究杜香多糖的抗氧化性、穩(wěn)定性、分子剛性等對于杜香的綜合開發(fā)利用具有重要意義。本研究擬通過水提醇沉法提取杜香多糖［8］，利用紅外分析鑒定多糖基團，利用蒽酮硫酸法［9］測定杜香多糖粗物中多糖的含量，通過總還原力測定［10－12］和分別清除羥基自由基［13－16］、DPPH自由基［17－19］、超氧陰離子［20－22］能力4種 評價方法，分析杜香多糖的抗氧化活性。并采用一般材料分析方法分析杜香多糖的物理性質，為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜香：由內蒙古金河林業(yè)局提供，經(jīng)北京林業(yè)大學植物專家鑒定，自然風干后磨粉并過40目篩，放干燥器中備用；

1，1－二 苯 基－2－苦 肼 基 （1，1－dipheny1－2－picrylhydrazyl，DPPH）、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、VC、鐵氰化鉀、三氯乙酸、2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚（BHT）、三氯化鐵、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、氫氧化鈉、鄰菲羅啉：分析純，北京化工廠。

1.2 試驗儀器

FT－IR紅外光譜儀：Tensor27型，德國Bruker公司；

熱重分析儀：TGA60型，日本Shimadzu公司；

旋轉蒸發(fā)儀：RE－5203型，上海亞榮生化儀器廠；

電子天平：METTLER TOLEDO型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；

X射線衍射儀：XRD－6000型，日本Shimadzu公司；

凍干機：LL1500型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

分光光度計：普析T6型，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 杜香多糖的提取 采用水提醇沉法：準確稱取一定量的杜香枝葉粉，按1∶35（m∶V）加入去離子水，然后放入恒溫水浴震蕩箱中80℃震蕩6h，離心分離液體和固體粉末，向上清液中加入酒精至濃度為85%，置于4℃冰箱中靜置1h，然后分離固液兩相，固體為粗多糖。

1.3.2 杜香多糖純化 將1.3.1得到的樣品按1∶10（m∶V）加入石油醚處理5h進行脫脂，接著將脫脂樣品按1∶2（m∶V）溶解于去離子水中，加入酒精至濃度為85%，置于4℃冰箱中靜置1h，分離固液兩相，重復上述操作4次，然后采用Sevag法［23］脫蛋白，所得樣品在－110℃下冷凍干燥，便可得到杜香多糖成品。將脫脂脫蛋白和脫脂未脫蛋白的多糖樣品配成100μg/mL的溶液，利用紫外光譜分析脫脂、脫蛋白前后杜香多糖的變化。

1.3.3 杜香多糖的紅外分析 取少量樣品置于紅外光譜儀中進行測定，掃描分辨率2cm－1，掃描范圍為400～4 000cm－1，掃描次數(shù)32次［24］。

1.3.4 杜香多糖含量測定 采用蒽酮硫酸法［23］，并以葡萄糖為參照制作標準曲線。

1.3.6 杜香多糖的TG分析 準確稱取3～8mg的杜香多糖，放入綜合熱重分析儀內進行熱綜合（TG）分析測定，以考察杜香多糖的熱穩(wěn)定性。分析條件：掃描溫度20～600℃，升溫速度10℃/min，N2流速40mL/min［24］。

1.3.7 杜香多糖的X－RD分析 取一定量的杜香多糖于X射線衍射儀的樣品室內進行掃描，掃描范圍為5°～60°，在掃描范圍內以5°/min的變化速率進行X射線照射，利用得到的數(shù)據(jù)繪制XRD衍射強度曲線圖，并計算出樣品的結晶度。根據(jù)衍射角與衍射強度的關系繪制XRD曲線。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Excel（Office 2007）軟件整理數(shù)據(jù)，Orgin軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 杜香多糖純化結果分析

由圖1可知：未脫蛋白前，杜香多糖溶液在280nm處有明顯的吸收峰，說明其含有蛋白成分。脫蛋白后的樣品在280nm處沒有明顯的吸收峰，說明其不含蛋白。與未脫蛋白的樣品進行比較，同一波長下，脫蛋白樣品的吸收值偏低，這可能是因為未脫蛋白的多糖樣品中含有一定的核酸及蛋白，這兩種物質含有一定數(shù)量的堿基和疏水基團，從而使樣品的紫外吸收產(chǎn)生增色效應。脫蛋白后，蛋白、核酸被除去，產(chǎn)生增色效應的基團也被除去，樣品紫外吸收恢復正常，因而在同一波長下，脫蛋白的多糖樣品比未脫蛋白的多糖樣品紫外吸收值要略低。

圖1 杜香多糖樣品紫外掃描光譜Figure 1 UV scanning spectrum of polysaccharide fromLedum palustre L.

2.2 杜香多糖紅外分析

由圖2可知，譜圖在3 389cm－1和1 156～1 024cm－1的峰分別為O—H和C—O的伸縮振動，1 024cm－1的較強吸收也說明了杜香多糖中可能有葡萄糖結構，2 889cm－1的尖峰以及1 567～1 370cm－1的峰分別為C—H的伸縮振動和變角振動，1 648cm－1處出現(xiàn)吸收峰，推測該峰為醛基中CO的伸縮振動引起的，譜圖在1 648cm－1波數(shù)處還出現(xiàn)一較強的吸收峰，說明杜香多糖中可能有酰氨取代基，譜圖在903cm－1波數(shù)處還出現(xiàn)吸收峰，說明杜香多糖可能含有β－型糖苷鍵。總之，杜香水提醇沉物具有多糖的一般吸收峰，證明杜香水提醇沉物為杜香多糖。

圖2 杜香多糖的紅外光譜圖Figure 2 IR spectrum of polysaccharide fromLedum palustre L.

2.3 杜香多糖含量的測定結果

由圖3可知：在含量為0.00～0.05mg/mL的范圍內，葡萄糖含量與吸光度線性關系良好。標準曲線方程為y＝9.79x－0.002，回歸系數(shù)R2＝0.995。測得杜香粗提物的吸光值為0.272，從而計算出杜香多糖粗提物中多糖的含量為69.95%。

圖3 葡萄糖標準曲線Figure 3 Standard curve of glucose

2.4 杜香多糖抗氧化結果分析

2.4.1 清除DPPH·的能力 由圖4可知：抗氧化劑（Vc，BHT等）明顯比杜香多糖的清除能力強，這是因為抗氧化劑采用的是純品，單位體積內濃度相對較高，而制備的杜香多糖粗提物純度相對較低所致。隨濃度升高，杜香多糖對DPPH·的清除率呈明顯上升趨勢，在0.60mg/mL處，達到54.70%。利用線性關系得出杜香多糖清除DPPH·的EC50值為0.52mg/mL。

圖4 杜香多糖與Vc、BHT清除DPPH·能力的比較Figure 4 The scavenging rate of DPPH radical on polysaccharide from Ledum palustre L.compared with Vc，BHT

2.4.2 清除·OH的能力 由圖5可知：隨濃度升高，杜香多糖和VC對·OH的清除率呈遞增趨勢；VC對·OH的清除效果明顯優(yōu)于杜香多糖。當濃度為1.00mg/mL時，杜香多糖的清除率為40.97%。利用線性關系得出杜香多糖對·OH的EC50值為1.41mg/mL。

圖5 杜香多糖與Vc清除·OH能力的比較Figure 5 The scavenging rate of hydroxyl radical on polysaccharide from Ledum palustre L.compared with Vc

圖6 杜香多糖與BHT清除·能力的比較Figure 6 The scavenging rate of superoxide anion radical on polysaccharide fromLedum palustre L.compared with BHT

2.4.4 總還原力 還原能力的測定是以樣品是否為有效的電子供應者為評價指標的。若是有效的電子供應者，其供應的電子可將Fe3＋還原成Fe2＋，還可與自由基形成較惰性物質，從而中斷自由基連鎖反應。一般情況下，物質的吸光度越大，還原能力越強，其抗氧化能力也越高［25］。由圖7可知：隨濃度增加，吸光度值增加趨勢比較平緩，相同濃度時抗氧化劑BHT的總還原能力明顯優(yōu)于杜香多糖。杜香多糖的還原力隨濃度的增加呈線性增加，杜香多糖的還原力在0.95～1.00mg/mL范圍內高于0.095～0.100mg/mL的BHT的溶液，還原力較強。

2.5 杜香多糖物理性質分析結果

圖7 杜香多糖與Vc、BHT還原力的比較Figure 7 The reducing power of polysaccharide fromLedum palustre L.compared with Vc，BHT

圖8 杜香多糖失重圖（氮氣保護）Figure 8 TGA analysis of polysaccharide fromLedum palustre L.under N2condition

2.5.1 熱重分析 由圖8可知，杜香多糖具有2次明顯的失重過程，這與多糖的含水量、組成和聚集態(tài)等有關。第1次失重出現(xiàn)在78℃左右，失重率為1.50%，可能是多糖受熱失水形成的失重峰；第2次失重出現(xiàn)在190～550℃，失重率為41.97%，此溫度區(qū)間的失重快，說明杜香多糖在該溫度范圍內發(fā)生了劇烈的分解反應，也說明在190℃以內時，杜香多糖是相對穩(wěn)定地發(fā)生熱裂解。550℃以后的溫度范圍，杜香多糖失重率為13.80%，說明在這個范圍內，杜香多糖進一步降解。

2.5.2 X射線衍射分析 由圖9可知，杜香多糖的X射線衍射強度曲線最高峰出現(xiàn)在2θ為20°附近，且峰形圓頓，基本呈現(xiàn)典型饅頭峰的特性，說明結晶度較低。2θ為30°和40°時，有2個圓頓的小肩峰，也說明了其結晶度低。這可能是因為杜香多糖是由幾種多糖混合而成的一種混合性多糖，不同成分的衍射強度曲線的最高峰出現(xiàn)的2θ位置不同，從而產(chǎn)生了肩峰現(xiàn)象。總體來說，杜香多糖的結晶度低（3.6%），分子剛性較差。這也可以作為鑒定杜香多糖的一種方式。

圖9 杜香多糖的X－衍射強度曲線圖Figure 9 XRD intensity curves of polysaccharide fromLedum palustre L.

3 結論

杜香多糖具有一定的抗氧化活性，并與濃度呈一定的函數(shù)關系，且在一定范圍內隨濃度增高，其活性逐漸增強。杜香多糖清除DPPH·、·、·OH的EC50值分別為0.52，1.41，1.71mg/mL，還原力接近 BHT并與濃度呈正相關。杜香多糖結晶度低，分子剛性差，其在190℃溫度范圍內穩(wěn)定，超過該溫度，將發(fā)生劇烈的熱分解使其失重。本試驗研究了杜香多糖的理化性質，可為其開發(fā)利用提供一定的理論基礎。但關于杜香多糖的純化、單糖分析及結構鑒定仍需進一步的研究。

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