金黃色葡萄球菌LAMP可視化快速檢測方法的建立

宋濤平 邱華麗 王淑娟 彭新凱 楊麗霞（長沙市食品質量安全監督檢測中心，湖南 長沙 410013）

近期中國衛計委通報了2014年全國食物中毒事件情況，突發公共衛生事件網絡直報系統全年共收到26個省份（含自治區、直轄市）食物中毒類突發公共衛生事件報告160起，中毒人數5 657人，其中死亡人數110人；而微生物性食物中毒人數最多，占中毒人數67.7%；且微生物性食物中毒事件主要由沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等引起［1］。在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒事件也占到整個細菌性食物中毒事件的33%；加拿大更高達45%［2］。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是革蘭氏陽性菌，為全球最常見的食源性致病菌之一，其引起的食物中毒在細菌性食物中毒中占有較大比例［3］。人類因食用受其污染的肉、奶、魚、蛋類及其制品等食品而感染，主要會引起食物中毒及肺炎、心包炎、敗血癥等疾病［4－6］。金黃色葡萄球菌可在溫度7.0～48.5℃、pH 4.2～9.3及高鹽（高達15%NaCl）的環境條件下生存，這些特點皆有利于其污染不同的食品［7］。因此，建立快速、靈敏、可靠的食源性致病菌金黃色葡萄球菌的檢測方法，對預防和控制致病菌引起的中毒事件發生，增強食品安全性具有重要意義。

傳統致病菌檢測以生化培養檢測方法為主，檢測時間較長，且靈敏度較低。PCR技術靈敏度高、特異性強，常被用于致病菌檢測，但需要后續電泳檢測，增加了污染的風險［8，9］。同時，實時熒光PCR技術也可用于致病菌檢測［10－12］，但其設備、試劑昂貴，且需經過專業培訓的人員操作，對實驗室環境條件的要求也較高，只有專業實驗室才能具備上述條件，基層單位難以開展此類檢測。

環 介 導 等 溫 擴 增 （loop－mediated isothermal amplification，LAMP）技術是利用BstDNA聚合酶在60～65℃恒溫條件下完成核酸的擴增［13］。BstDNA聚合酶在較高鎂離子濃度條件下，才具有5＇→3＇外切酶活性［14］。該酶80℃處理15min即可失活。在LAMP反應中，需要針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，在恒溫條件下進行核酸擴增［13］。環引物的加入可縮短反應時間［15］。LAMP技術已廣泛應用于致病菌的檢測，包括金黃色葡萄球菌［16］、大腸桿菌O157［17］、沙門 氏 菌［18，19］、副 溶 血 性 弧 菌［20，21］、綠 膿 假 單 胞菌［22］、單核細 胞 增 多 性 李 斯 特 菌［23］、阪 崎 腸 桿 菌［24］。 目 前已報道的LAMP技術主要是采用濁度儀或反應后加入顯色劑，根據濁度或顏色的變化進行結果判斷，濁度法需要較為貴重的濁度儀，而反應后加入顯色劑SYBR GreenⅠ，開蓋容易造成氣溶膠污染，反應前加入高濃度SYBR GreenⅠ對反應有抑制作用。因此，急需建立一種更適合基層使用的反應前加入顯色劑，且無需開蓋、無需大型儀器設備的LAMP擴增技術。

本研究擬采用實時熒光LAMP技術，根據擴增時間和熒光強度篩選最佳引物組合，并最終運用金屬離子指示劑羥基萘酚藍［25］（hydroxy naphthol blue，HNB）判定反應結果，使LAMP的結果判斷更簡單直觀，旨為建立適合在基層檢測單位推廣使用的金黃色葡萄球菌LAMP可視化快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸埃希氏桿菌、阪崎腸桿菌、銅綠假單胞菌、產氣莢膜梭菌、糞腸球菌、副溶血性弧菌：美國典型菌種保藏中心（ATCC）；

鼠傷寒沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、β溶血性鏈球菌、志賀氏菌：中國醫學微生物菌種保藏管理中心（CMCC）；

大腸埃希氏菌O157：H7：英國國家標準菌種保藏中心（NCTC）；

金黃色葡萄球菌：由本實驗室依據GB/T 4789.10—2010從食品中分離鑒定。

1.2 主要試劑和儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；

DNA等溫擴增試劑盒：廣州迪澳生物科技有限公司；

羥基萘酚藍（HNB）：美國Sigma公司；

DL 1，000DNA Marker、Premix TaqTM：大連寶生物工程有限公司；

超微量核酸蛋白分析儀：BD1000型，北京五洲東方科技發展有限公司；

干式恒溫器：K30B型，杭州奧盛儀器有限公司；

實時熒光定量PCR儀：7500FAST型，美國應用生物系統公司。

1.3 細菌基因組DNA提取

按細菌基因組DNA提取試劑盒使用說明書操作。

1.4 LAMP引物的設計與合成

針對金黃色葡萄球菌的特異性基因nuc和femA，參照文獻［26］和SN/T 2754.1—2011中引物序列（見表1），合成2套LAMP引物，用于篩選最佳引物組合，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.5 LAMP體系建立

LAMP反應體系25μL，包括：F3、B3濃度為0.2μmol/L，FIP、BIP濃度為1.6μmol/L，LB、LF濃度為0.3μmol/L（無環引物加雙蒸水補足體積），2×反應緩沖液12.5μL，8UBst DNA聚合酶1μL，DNA模板2μL。將反應體系于63℃恒溫反應45min。實時熒光LAMP反應體系中加SYTO－9熒光染料0.5μL，在實時熒光定量PCR儀上完成反應；顯色法加3mmol/L HNB 0.5μL，在干式恒溫器上完成反應。

1.6 靈敏度分析

將100ng/μL的金黃色葡萄球菌基因組DNA進行10倍梯度稀釋，使得濃度梯度依次為100，10，1，0.1，0.01，0.001，0.000 1ng/μL。以此為模板進行LAMP擴增。平行進行PCR法檢測金黃色葡萄球菌靈敏度的試驗，對比分析兩種方法的檢測靈敏度。PCR法反應體系：2×Premix Taq 12.5μL，引物nuc－F3/nuc－B3（10μmol/L）各0.5μL，100ng DNA模版，補滅菌蒸餾水至25μL。反應程序為94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s共進行35個循環，最后72℃5min。

1.7 特異性分析

利用建立的LAMP法對表2中菌株的基因組DNA進行擴增，驗證本方法的特異性。同時，使用金黃色葡萄球菌可視化LAMP檢測法對按照GB/T 4789.10—2010的方法從肉類及蛋奶制品等樣品中分離得到的野生菌株進行驗證檢測，并平行進行普通PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 最佳引物篩選

按上述反應體系，以金黃色葡萄球菌DNA為模板，運用2套LAMP引物分別進行實時熒光LAMP擴增，比較其擴增效率篩選最佳引物組合，圖1為最佳引物篩選結果。由圖1可知，nuc、femA引物組的擴增出峰時間分別為11.7，31.6min，而nuc引物組的擴增熒光強度明顯高于femA引物組。因此選擇nuc引物組進行后續試驗。

2.2 LAMP法與PCR法檢測靈敏度比較

在反應前加入HNB作為LAMP擴增的指示劑，根據HNB的顏色變化進行結果判定，陽性呈天藍色，陰性為紫羅蘭色。用nuc引物組，以金黃色葡萄球菌DNA為模板，用去離子水進行10倍系列稀釋，分別進行LAMP、PCR法檢測，比較兩者靈敏度，結果見圖2。由圖2可知，LAMP法和PCR法靈敏度基本相同，都可以達到0.001ng/μL，但PCR法在0.001ng/μL的電泳條帶較弱。

圖1 最佳引物篩選Figure 1 Screening the best primers

圖2 金黃色葡萄球菌檢測靈敏度結果Figure 2 Detection sensitivity of Staphylococcus aureus

從試驗易操作性、結果判定直觀角度考慮，LAMP可視化檢測法更適合現場快速檢測。

2.3 LAMP特異性試驗結果

利用建立的金黃色葡萄球菌LAMP法對表2中的13個種類共計27株細菌進行特異性試驗，采用去離子水作為陰性對照。其中15株金黃色葡萄球菌為LAMP陽性結果、其他菌為陰性結果，與平行進行的普通PCR法檢測結果一致，表明本試驗所用的LAMP引物具有高度特異性。

表2 特異性分析結果Table 2 Results of LAMP specific amplification

3 討論

本研究通過實時熒光LAMP法對金黃色葡萄球菌的2套LAMP引物進行篩選，比較其出峰時間、熒光強度確定最佳引物組合。采用在反應前添加金屬離子指示劑HNB，通過肉眼直接觀察顏色變化進行判定，若反應液由紫羅蘭變為天藍色，即為陽性。本試驗建立了金黃色葡萄球菌可視化LAMP反應體系，檢測靈敏度為0.001ng/μL，與普通PCR相當，且特異性良好，與其他種類的致病菌無交叉反應。HNB作為LAMP反應顯色劑，結果易于識別，且與普通PCR一致，說明基于HNB染料的LAMP檢測結果可信。

本研究建立了金黃色葡萄球菌可視化快速檢測方法，在63℃恒溫條件下反應45min便可直接判定結果，無需特殊儀器設備，簡便易行，可用于食品安全現場監督檢驗和基層快速檢測。

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