酸性電解水處理后南美白對蝦貯藏過程中腸道微生物的多樣性變化

付嬌嬌，彭織云，劉海泉，孫曉紅，潘迎捷，趙　勇，*

（1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306；3.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海），上海201306）

酸性電解水處理后南美白對蝦貯藏過程中腸道微生物的多樣性變化

付嬌嬌1，2，3，彭織云1，2，3，劉海泉1，2，3，孫曉紅1，2，3，潘迎捷1，2，3，趙勇1，2，3，*

（1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306；3.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海），上海201306）

腸道微生物是引起水產品腐敗變質的主要污染源之一。酸性電解水（AEW）作為新型環保消毒劑，因其高效廣譜殺菌的特點，已逐漸被應用于水產品安全控制方面并且日益受到人們的重視。本研究采用變性梯度凝膠電泳技術，分析了經自來水（TW）與酸性電解水分別處理的南美白對蝦（Penaeus vannawei）于0、4、25℃貯藏過程中腸道微生物多樣性的變化規律。結果表明，與對照相比，經酸性電解水處理后的樣品腸道微生物多樣性在貯藏過程中有所減少。因此，酸性電解水能明顯改變腸道微生物的多樣性，為其保障水產品質量安全提供了理論參考依據。

南美白對蝦，酸性電解水，腸道微生物，變性梯度凝膠電泳（DGGE）

南美白對蝦因其營養價值高、肉質鮮美而廣受消費者喜愛，但其在運輸、生產加工、貯藏過程中易腐敗變質[1]。近年來，藍蔚青等[2]探討了鯧魚冷藏過程中不同種類細菌的變化規律。陳慧斌等[3]研究了4℃冷藏期間牡蠣鰓部菌群的動態變化，但很少有人關注水產品貯藏過程中腸道細菌的種群變化。腸道微生物是引起水產品腐敗變質的主要因素之一，因此，研究水產品腸道細菌結構在貯藏過程中的變化規律尤為重要。通過選擇不同的保鮮劑和包裝方式，可以改善水產品的貯藏品質，延長貨架期[4]。已有研究表明乳酸菌生物保護劑可以有效抑制冷凍水產品中單增李斯特菌的生長[5]。徐曉瑾等[6]研究發現氣調包裝是一種有效地抑菌包裝方式，可延長生鮮冷卻牛肉的保鮮期。相比于其他化學殺菌劑，酸性電解水具有安全性好，快速、廣譜殺菌的特點[7-8]。因此，研究電解水在食品安全方面的應用具有現實意義。藍蔚青等[9]研究表明酸性電解水能在短時間內抑制細菌生長，使帶魚的冷藏貨架期延長2～3d。謝軍等[10]發現酸性電解水能有效減少蝦體細菌總數，但酸性電解水在延長水產品貨架期的同時是否改變了其腸道微生物的結構尚未見報道。

PCR-DGGE技術被廣泛應用于微生物菌落多樣性和種群差異研究，目前已經成為微生物分子生態學研究的主要方法之一[11-13]。本文基于PCR-DGGE技術，分析了經自來水與酸性電解水處理后南美白對蝦腸道微生物種群結構多樣性的變化規律，為進一步控制南美白對蝦貯藏過程中的腐敗變質及酸性電解水技術在水產品安全中的應用提供了參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

南美白對蝦購于上海市普陀區銅川路水產品市場。實驗選取相同規格的個體（平均約25g），將其分為A、B兩組，樣品分別編號a～r。A組用自來水，B組用50ppm的酸性電解水分別浸泡1min后放入均質袋中，置于0、4、25℃條件下貯藏。分別采集貯藏0、1、3、4、6d蝦腸道0.1g于1.5mL離心管中，-80℃保存。

FW-200型強酸性電解水生成器日本Amano公司；高精度恒溫培養箱日本Sanyan公司；BagMixer 400 VW型拍打式均質器法國Interscience公司；離心機、PCR擴增儀德國Eppendorf公司；DGGE電泳儀、Bio-Rad凝膠成像儀分析系統美國BioRad公司；PCR試劑盒中國上海LifeFeng公司；腸道DNA提取試劑盒德國Qiagen公司；酶標儀美國BioTek公司。

1.2實驗方法

1.2.1腸道微生物群落總DNA提取使用腸道DNA提取試劑盒提取腸道樣品的總DNA，提取步驟按說明書操作，提取后的DNA置于-20℃保存待用。

1.2.2PCR擴增選取細菌16S rDNA的V3可變區進行PCR擴增。引物序列如下：上游引物V3-2：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’和帶GC夾子的下游引物V3-3：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’。25μL PCR反應體系為：PCR mix 12.5μL、引物V3-2和V3-3各1μL、ddH2O 8.5μL，DNA模板2μL。PCR擴增程序為：95℃預變性3min；95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸30s，20個循環；72℃延伸10min。取5μL PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker選用DL2000，紫外檢測擴增產物，凝膠成像。

1.2.3變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）將PCR產物用DGGE分離，凝膠的配制采用8%聚丙烯酰胺凝膠，其中變性劑濃度梯度為35%～60%（100%的變性膠包含7mol/L尿素和40%甲酰胺）。PCR擴增產物上樣量為8μL，上樣前調整PCR產物的濃度使濃度一致。采用D code DGGE（Bio-Rad）進行電泳，電泳緩沖液為1×TAE（Tris-磷酸），在60℃條件下120V電壓電泳4h左右。凝膠染色，電泳結束后，凝膠于EB染液中染色20min，用Bio-Rad凝膠成像系統采集圖像。

1.3數據分析

利用Quantity One 4.6.2軟件將DGGE圖譜數字化后得到每個樣品中可檢測條帶的細菌豐度，有條帶記為“1”，無條帶則記為“0”。將輸出的數據結果導入NTSYS-pc 2.10e軟件，比較各個泳道之間的相似性，并進行UPGAMA聚類分析并采用Canoco for Windows 4.5軟件進行主成分分析。根據電泳圖譜中每個條帶的亮度，用香濃-威納多樣性指數（Shanno-Wiener index，H）分析各樣品多樣性。公式如下：

式中，H為香濃-威納多樣性指數，S為DGGE膠中條帶數量，Pi為i條帶所占百分比。

2　結果與分析

2.1DGGE圖譜分析及多樣性分析

18個樣品的DGGE電泳結果如圖1所示。不同位置的條帶代表不同種屬細菌，條帶的熒光強度則反映了該細菌的豐富度，條帶信號越亮，表示該種屬細菌的相對數量越多[14]。由圖1可知，每個樣品中強度高的條帶在泳道中的遷移率不同，說明各樣品中優勢菌群有所不同，直觀地反映了南美白對蝦貯藏過程中腸道微生物的多樣性。比較圖1中0℃貯藏條件下自來水（TW）與酸性電解水（AEW）分別處理的樣品，其腸道細菌的結構存在明顯的多樣性差異，此現象同樣出現在4℃及25℃條件貯藏過程中。表明酸性電解水改變了腸道微生物的多樣性。

圖1　各樣品16S rDNA基因擴增產物的DGGE電泳結果Fig.1　DGGE electrophoresis of 16S rDNA gene amplification products from the samples

根據DGGE圖譜數字化結果可得，經自來水處理于0、4、25℃條件下貯藏的三組樣品（a、c、e、g，i、k、m，o、q）分別在DGGE圖譜上產生11、9、12、13，11、10、13，10、11條可以鑒別的條帶；同樣，經酸性電解水處理于0、4、25℃條件下貯藏的三組樣品（b、d、f、h，j、l、n，p、r）分別在DGGE圖譜上產生11、10、13、9，15、13、10，11、10條可以鑒別的條帶，條帶數量的多少反映了該樣品代表的腸道環境中細菌的多樣性程度。結果顯示，自來水處理的樣品在0、4、25℃條件下貯藏過程中，其腸道微生物菌群結構多樣性呈上升趨勢，而在酸性電解水處理樣品中有所下降，表明酸性電解水對蝦腸道細菌增殖有一定的抑制作用。觀察DGGE圖譜中S位置上的條帶，發現其在泳道上處于相似位置。該結果可推測貯藏過程中對蝦腸道內存在某一穩定增殖的細菌，但并不能認為這些條帶所代表的就一定是同樣的細菌。

多樣性指數（H′，Shannon-wiener index）是研究群落物種數和個體數及其分布均勻度的綜合指標[15]。由表1可知，多樣性指數在整個監測周期內呈周期性波動變化，說明了對蝦腸道內微生物群落結構在時間上的演替變化。分析0℃及4℃貯藏條件下的兩組樣品，發現貯藏時間達到48h之后，腸道菌群的多樣性開始明顯增加，表明腸道細菌種類在貯藏前期發生了改變。此外，酸性電解水處理后的樣品在貯藏48h時腸道細菌的多樣性指數最低，表明其高效的抑菌作用。分析25℃條件下貯藏的樣品，實驗結果顯示當貯藏時間達到24h時，酸性電解水處理樣品的腸道細菌多樣性指數略低于自來水處理樣品，可進一步表明酸性電解水的抑菌作用。

表1　樣品細菌種群多樣性指數Table.1　Shannon-Wiener index

2.2DGGE圖譜的聚類分析及主成分分析

UPGAMA相似性聚類分析結果（表2）顯示，所有樣品相似性在0.44～1.0，說明各樣品腸道種群結構有所差異。由圖2可知，不同貯藏溫度下，自來水與酸性電解水處理的第0d腸道樣品被聚為一類，顯示出它們具有較為相似的種群結構，其平均相似系數為0.93。隨著貯藏時間的增加，樣品間的相似系數逐漸降低，如酸性電解水處理樣品于4℃貯藏第0d與第3d的相似系數僅為0.44，表明酸性電解水明顯改變了腸道微生物的多樣性及腸道微生物種類變化主要發生在貯藏前期。

圖2　DGGE圖譜的聚類分析Fig.2　Cluster analysis of DGGE fingerprinting profile

表2　樣品腸道微生物相似系數Table.2　Similarity coefficients of intestinal microorganisms of samples

DGGE圖譜的PCA分析結果如圖3所示。樣品之間的距離代表了它們的差異大小。主成分因子1（PC1）的貢獻率為32.9%，主成分因子2（PC2）的貢獻率為14.4%；PC1明顯地將樣品分成2個部分，自來水處理的樣品（1～9）集中分布在圖的左邊，酸性電解水處理的樣品（10～18）分散在圖的右邊。表明自來水處理與酸性電解水處理的樣品腸道細菌結構多樣性存在明顯差異。此外，圖中酸性電解水處理的樣品分布比較發散，表明其明顯影響了腸道微生物的多樣性。圖中8、9是經自來水處理于25℃條件下貯藏第0d與第1d的腸道樣品，該貯藏溫度下的樣品間距相差較大，此現象同樣出現在酸性電解水處理組（17～18）。表明在25℃環境條件下，細菌適宜生長從而使腸道微生物多樣性發生了較大的改變。

圖3　DGGE圖譜的PCA分析Fig.3　PCA analysis of DGGE fingerprinting profile

3　結論與討論

DGGE方法有不需要培養、分辨率高、結果準確可靠、重復性好、檢測速度快、可同時檢測多種微生物等優點[16]，在本研究中，16S rDNA V3區的PCRDGGE圖譜能夠很好地區分蝦腸道內的細菌，雖然數據不能代表所有對蝦腸道內細菌群落的情況，但可以說明PCR-DGGE技術能夠有效地用于腸道菌群的分析。

酸性電解水作為一種新型的環保殺菌劑，已逐步應用于食品保鮮中。近年來，國內外學者均有關于電解水殺菌效果的研究報道。李秀麗等[17]研究表明酸性電解水能有效減少熟制蝦仁中的細菌總數；李華貞等[18]研究表明酸性電解水可以抑制新鮮果蔬中的細菌增殖，延長其保鮮期。林婷、Abdulsudi等[19-20]研究結果同樣表明酸性電解水具有高效的抑菌作用，而這些研究都是基于酸性電解水對食品表面微生物的作用效果。由于腸道微生物也是引起水產品腐敗變質的主要污染源之一，所以本研究重點關注酸性電解水處理后的水產品在貯藏過程中腸道微生物多樣性的變化。由實驗結果可知，酸性電解水處理的蝦樣腸道微生物多樣性在貯藏過程中有所減少并且與對照組存在明顯差異，不僅進一步證明了酸性電解水具有高效抑菌的作用，同時揭示了其能夠顯著影響水產品腸道微生物的多樣性，這可能與延長水產品貨架期有關。研究還發現經兩種不同方式處理的樣品，其腸道微生物優勢種群在貯藏前期都發生了明顯的改變，因此在鮮蝦安全控制中應在前期采取有效措施以改善食品品質。此外，DGGE圖譜中S位置上的條帶細菌在樣品貯藏過程中穩定存在，但不能認為就是同一種細菌，這些細菌可能是引起水產品貯藏過程中腐敗變質的特定腐敗菌。因為本文重點關注的是酸性電解水處理的水產品在貯藏過程中腸道微生物多樣性的變化，所以沒有對單一條帶進行深入的分析。

酸性電解水的研究主要集中在其高效的殺菌效果，而其在影響水產品品質方面也有相關報道。已有研究表明電解水能夠減少冷藏河豚魚中揮發性鹽基氮、pH、硫代巴比妥酸值等品質指標的變化，同時還可以減少河豚魚肉的硬度、彈性和回復性等質構結果的變化，從而延長了冷藏河豚魚的貨架期[21]。謝軍等[22]研究表明電解水浸泡生蝦后基本上不影響其感官品質，可以代替自來水用于原料蝦的清洗。結合本研究結果表明，酸性電解水具有高效、廣譜殺菌的作用且能夠顯著改變腸道微生物的多樣性，為其保障水產品質量安全提供了參考依據以及為探討酸性電解水延長水產品貨架期的機理提供了理論支撐。

[1]周娟娟，馬海霞，李來好.南美白對蝦冰溫氣調保鮮效果評價[J].食品科學，2012，33（22）：332-336.

[2]藍蔚青，謝晶，施建兵，等.冷藏鯧魚貯藏期間的細菌種群變化[J].食品與生物技術學報，2013，32（11）：1141-1148.

[3]陳慧斌，劉智禹，陳紹軍，等.基于PCR-DGGE技術的冷藏牡蠣鰓部菌群分析[J].西南大學學報：自然科學版，2013，35（4）：151-156.

[4]謝晶，楊勝平.生物保鮮劑結合氣調包裝對帶魚冷藏貨架期的影響[J].農業工程學報，2011，27（1）：376-380.

[5]呂欣然，白鳳翎，勵建榮.乳酸菌生物保鮮在水產品種的應用研究進展[J].食品工業科技，2014，35（2）：340-345.

[6]徐曉瑾，歐杰，嚴維凌，等.氣調包裝生鮮冷卻牛肉貯藏中微生物多樣性分析[J].微生物學通報，2012，39（12）：1852-1858.

[7]Venkitanarayanan K S，Ezeike G O.Efficacy of electrolyzed oxidizing water for inactivating Escherichia coli O157：H7，Salmonella enteritidis and Listeria monoyctogenes[J].Applied and Environmental Microbiology，1999，65（9）：4276-4279.

[8]Tanaka N，Fujisawa T，Daimon T，et al.The effect of electrolyzedstrongacidaqueoussolutiononhemodialysis equipment[J].Artificial Organs，1999，23（12）：1055-1062.

[9]藍蔚青，謝晶.酸性電解水與溶菌酶對冷藏帶魚品質變化的影響[J].福建農林大學學報：自然科學版，2013，42（1）：100-105.

[10]謝軍，孫曉紅，潘迎捷，等.應用PCR-DGGE監測酸性電解水對蝦的殺菌效果[J].食品科學，2011，32（9）：1-6.

[11]謝科，余曉峰，鄭海松，等.傳統分離培養結合PCR-DGGE技術分析廣式臘腸中優勢菌[J].食品科學，2013，34（4）：157-160.

[12]Susana D，Caio T C C R，Elena F，et al.Diversity of thermophilic bacteria in raw，pasteurized and selectively-cultured milk，as assessed by culturing，PCR-DGGE and pyrosequencing [J].Food Microbiology，2013，36：103-111.

[13]Edna F A，Aly F EL S，Tomasz R，et al.Determination of cheese origin by using 16S rDNA fingerprinting of bacteriacommunities by PCR-DGGE：Preliminary application to traditional Minas cheese[J].Food Control，2013，30：1-6.

[14]李江宇，樊景鳳，穆貴強，等.利用PCR-DGGE分析海水浴場細菌多樣性[J].海洋環境科學，2013，32（4）：523-528.

[15]Ogino A，koshikawa H，Nakahara T，et al.Succession of microbialcommunitiesduringabiostimulationprocessas evaluated by DGGE and clone library analyses[J].Journal of Applied Microbiology，2001，91：625-635.

[16]羅佳捷，李麗立，張彬.PCR-DGGE技術及其在微生物群落結構研究中的應用[J].廣東畜牧獸醫科技，2009，34（5）：17-19.

[17]李秀麗，吳冬梅，羅紅宇.酸性電解水對熟制蝦仁抑菌作用的研究[J].食品工業，2013，34（9）：108-110.

[18]李華貞，鄭淑方，宋曙輝，等.酸性電解水對果蔬殺菌及保鮮效果的研究[J].現代食品科技，2011，27（3）：361-365.

[19]林婷，王敬敬，潘迎捷，等.酸性電解水對純培養及食品中食源性致病菌殺菌效果比較研究[J].食品科學，2013，34（15）：69-74.

[20]Abdulsudi I，Yoshinori K，Nami M，et al.Application of slightly acidic electrolyzed water as a potential non-thermal food sanitizer for decontamination of fresh ready-to-eat vegetables and sprouts[J].Food Control，2011，22：601-607.

[21]周然，劉源，謝晶，等.電解水對冷藏河豚魚肉質構及品質變化的影響[J].農業工程學報，2011，27（10）：365-369.

[22]謝軍，孫曉紅，潘迎捷，等.電解水和有機酸對蝦的殺菌效果及感官品質影響[J].食品與發酵工業，2010，36（5）：57-63.

Changes of acidic electrolyzed water on intestinal microflora diversity of Penaeus vannawei during storage

FU Jiao-jiao1，2，3，PENG Zhi-yun1，2，3，LIU Hai-quan1，2，3，SUN Xiao-hong1，2，3，PAN Ying-jie1，2，3，ZHAO Yong1，2，3，*
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation，Shanghai 201306，China；3.Laboratory of Quality Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation（Shanghai），Ministry of Agriculture，Shanghai 201306，China）

Intestinal microflora was considered as one of the major sources to cause the corruption of aquatic products.As a new-type environmental disinfectant，acidic electrolyzed water（AEW）had gradually been applied to control the security of aquatic products，which was receiving more and more attentions due to its efficient broad-spectrum sterilization.In this paper，PCR-DGGE technology was used to analyze the variation of intestinal microflora diversity in Penaeus vannamei stored at 0℃，4℃and 25℃，which were treated by tapwater（TW）and AEW，respectively.Compared with TW group，samples under AEW showed a decreasing diversity of intestinal microflora during storage，which indicated that intestinal microflora diversity was significantly affected by AEW.The results would be used to provide a theoretical reference for the security of aquatic products.

Penaeus vannamei；AEW；intestinal microflora；DGGE

TS254.4

A

1002-0306（2015）04-0344-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.066

2014－05－06

付嬌嬌（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品預測微生物學及定量風險評估。

趙勇（1975-），男，博士，教授，主要從事食品安全與食品生物技術方面的研究。

國家自然科學基金（31271870）；上海市科學技術委員會部分地方院校能力建設項目（11310501100）；上海市科學技術委員會科技創新行動計劃項目（12391901300）；上海市科技興農重點攻關項目（滬農科攻字2014第3-5號）。