大孔樹脂純化管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷的工藝研究

顧　云，孫虹霞，梁　昱，劉　昕

（中山大學生命科學大學院，廣東廣州510275）

GU Yun，SUN Hong-xia，LIANG Yu，LIU Xin*

（Grand School of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China）

大孔樹脂純化管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷的工藝研究

顧云，孫虹霞，梁昱，劉昕*

（中山大學生命科學大學院，廣東廣州510275）

本研究旨在探索大孔樹脂純化管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷的方法。通過靜態實驗篩選純化毛蕊花糖苷的最佳樹脂類型，并從洗脫劑濃度、洗脫時間、洗脫速度三個方面進行優化以得到該樹脂動態洗脫毛蕊花糖苷的最佳方法。結果顯示：HPD300對毛蕊花糖苷的吸附和解吸能力最強，其純化毛蕊花糖苷的最優條件為：吸附平衡后經超純水洗脫30min，之后依次用20%和50%的乙醇洗脫75min和60min，流速為10mL/min。純化后，毛蕊花糖苷的含量由5.26%提高至68.20%，回收率為68.90%。研究結果表明，采用大孔樹脂HPD300純化管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷，成本低，回收率和純度較高，適用于工業化生產。

管花肉蓯蓉，毛蕊花糖苷，大孔樹脂，純化

GU Yun，SUN Hong-xia，LIANG Yu，LIU Xin*

（Grand School of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China）

管花肉蓯蓉[Cistanche tubulosa（Schrenk）Wight]是列當科（Orobanchaceae）肉蓯蓉屬（Cistanche）多年生草本植物，是名貴的補益中草藥。以松果菊苷和毛蕊花糖苷為代表的苯乙醇苷類物質是管花肉蓯蓉的主要活性成分。研究發現管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷具有消炎、抗氧化、降低2型糖尿病小鼠血糖血脂等藥理功效[1-6]，但是管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的含量偏低。目前，國內外研究者通常采用色譜技術分離純化以得到純度和回收率較高的苯乙醇苷（主要指松果菊苷和毛蕊花糖苷）[7-11]，但是該技術工藝復雜，純化過程需要使用多種有機溶劑，成本昂貴，不適用于工業生產。與此同時，大孔樹脂也已經運用于苯乙醇苷的分離純化[12-15]，技術成熟，成本低，且純化過程只使用一種有機溶劑，適用于工業化生產；這些研究涉及到苯乙醇苷總苷的富集、松果菊苷的純化，但是尚未涉及毛蕊花糖苷的純化，本研究擬采用大孔樹脂純化毛蕊花糖苷粗樣，以期得到高純度的毛蕊花糖苷。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

毛蕊花糖苷樣品制備按照本實驗室建立的方法進行制備，制備后樣品溶液中毛蕊花糖苷的含量為5.26%±0.091%，濃度為7.57±0.21mg/mL，保存于4℃冰箱；乙醇和冰乙酸分析純；甲醇MERCK，色譜純；大孔樹脂HPD300，D101，AB-8，S-8購自河北滄州寶恩生物有限公司。

中壓制備色譜系統BUCHI公司；高效色相色譜系統美國Waters公司；恒溫搖床ZMY-2102C上海智誠有限公司；真空旋轉蒸發儀LABORRTA4001 Heidolph公司。

1.2實驗方法

1.2.1松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量檢測松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量按照高效液相色譜法[16]測定：Symmetry C18（5μm）色譜柱，Waters 1525色譜泵，2996紫外檢測器；流動相：0.5%乙酸（A），甲醇（B）；梯度洗脫條件：75%～60%A（0～10min），60%A（10～30min）；檢測波長：330nm；柱溫：30℃。

1.2.2大孔樹脂的預處理和含水量測定為了除去樹脂中殘留的交聯劑和致孔劑等有機溶劑，參照Lin等[17]的方法及產品的使用說明書進行大孔樹脂的預處理：首先用無水乙醇浸泡24h，使樹脂充分溶脹；之后用去離子水洗滌至無乙醇殘留。將處理過的樹脂搖勻，吸干表面水分，每種樹脂精確稱取3份，記質量為W1；80℃烘干至恒重，稱重，記質量為W2，按照公式（1）計算含水量（%）。

1.2.3靜態吸附和解吸實驗稱取一定量預處理過的樹脂（相當于1.0g干重）于三角瓶中，加50mL樣品溶液，120r/min室溫振蕩24h，過濾，測定濾液中毛蕊花糖苷的含量，根據公式（2）計算飽和吸附量。將吸附飽和的樹脂用去離子水洗滌，加50mL 95%的乙醇，120r/min室溫振蕩24h，過濾，測定濾液中毛蕊花糖苷的含量，根據公式（3）和（4）計算解吸量和解吸率。

其中，C0（mg/mL）和Ce（mg/mL）分別是初始以及吸附平衡后溶液中毛蕊花糖苷的濃度，Vi（mL）是初始樣品體積，W（g）是樹脂質量，Cd（mg/mL）是解吸溶液中毛蕊花糖苷的濃度，Vd是解吸溶液的體積（mL）。

根據靜態實驗選擇最佳樹脂型號，作為后續實驗使用樹脂。

1.2.4預處理后HPD300的有機溶劑殘留物檢測目前常見的大孔樹脂預處理大都以“加數倍水于乙醇溶液中不顯混濁”或“至200～400nm無紫外吸收峰”為合格標準[18]，賈存勤與鄧亮等[18-19]發現，對預處理后的大孔樹脂進行全波長掃描，若吸光值小于0.2，則氣相色譜法檢測不出苯、二甲苯等有機溶劑的殘留。以后者為標準，在預處理后的大孔吸附樹脂中加入無水乙醇（高出樹脂5cm），置于恒溫振蕩器上充分振蕩，過濾，濾液進行全波長掃描（200～800nm），檢測預處理后樹脂的有機溶劑的殘留情況。

1.2.5靜態吸附動力學稱取一定量預處理過的樹脂（相當于1.0g干重）于三角瓶中，加50mL樣品溶液，120r/min室溫振蕩16h。每隔1h測定溶液中毛蕊花糖苷的含量并計算吸附能力。以吸附能力為縱坐標，時間為橫坐標，繪制靜態吸附動力學曲線。

擬合準一級動力學和準二級動力學模型，以更好地了解吸附過程并確定樹脂的吸附類型[20-23]。

兩種模型的公式分別為（5）和（6）：其中，k1和k2分別是準一級動力學模型和準二級動力學模型的速度常數，qe是理論平衡吸附值，qt是不同時間的吸附值，t是吸附時間。

1.2.6吸附等溫線稱取8份一定量預處理過的樹脂（相當于1.0g干重）于8個三角瓶中，分別添加50mL 8種不同濃度的樣品溶液，120r/min振蕩24h，溫度分別為25、35、45℃。記錄初始濃度和吸附平衡時的濃度。參照公式分別對Langmuir（7）和Freundlich（8）吸附模型進行評估，

其中，Qe（mg/g）是平衡吸附量，qm（mg/g）是理論計算出來的最大吸附能力，Ce（mg/mL）是平衡濃度，KL是Langmuir常數，KF和1/n是Freundlich常數。

1.2.7動態吸附和解吸實驗稱取一定質量預處理的大孔樹脂HPD300，濕法裝柱，上樣，吸附平衡后用超純水洗脫，之后用不同濃度的乙醇（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）進行連續洗脫，洗脫時間均為30min，洗脫速度為10mL/min，制作解吸曲線以確定洗脫雜質和毛蕊花糖苷的乙醇濃度；分別以5、10、15mL/min的速度及確定濃度的乙醇進行不同時間的洗脫，以此確定最佳洗脫速度和洗脫時間。按照式（9）和式（10）計算純化后毛蕊花糖苷的純度和回收率。

其中，W1和W2指純化后樣品中毛蕊花糖苷的質量和樣品的總質量，W3指純化前樣品中毛蕊花糖苷的質量。

1.3數據處理

數據采用SPSS 18.0進行ANOVA單因素方差分析和多重比較分析，數據均表示為平均值±標準偏差，采用Excel 2010作圖。

2　結果與分析

2.1大孔樹脂含水量

樹脂的吸附特性跟樹脂的結構和極性等理化性質有著非常密切的關系。按照方法1.2.2進行四種類型大孔樹脂的含水量測定，總結其理化性質如表1。

2.2靜態吸附和解吸能力

樹脂的吸附特性跟樹脂的結構和極性等有密切的關系，選擇四種理化性質不同的樹脂，從中篩選對毛蕊花糖苷吸附和解吸能力最強的樹脂。HPD300對毛蕊花糖苷的吸附能力、解吸能力以及解吸率分別為（49.19±1.56）mg/g，（46.97±0.87）mg/g，（95.52±1.63）%（圖1），均顯著大于AB-8、D101和S-8（p＜0.05）。樹脂、待吸附物質和溶劑之間通過范德華力或者氫鍵相互作用[24]，從而影響吸附作用，根據“相似相容”原理[25]，相對于強極性的S-8和非極性的D101，弱極性的HPD300和AB-8對于極性相對較低的毛蕊花糖苷具有較強的吸附和解吸能力。而HPD300優于AB-8，可能是由于HPD300在比表面積方面的優勢。因此，選擇樹脂HPD300做后續實驗。

表1　實驗樹脂的理化性質Table.1　Physical properties of the tested macroporous resins

圖1　不同型號樹脂對毛蕊花糖苷的吸附/解吸能力和解吸率Fig.1　Adsorption/desorption capacities and desorption ratios of acteoside on different resins

2.3預處理后HPD300有機溶劑殘留的檢測

新購買的大孔樹脂可能會有反應不完全的交聯劑、致孔劑、分散劑等殘留在樹脂空穴內，直接使用會危害人體健康[26-27]，因此在使用前必須要進行預處理并檢測處理后有機溶劑的殘留量是否達到國家食品藥品監督管理局的要求。對預處理后HPD300有機溶劑殘留進行檢測，全波長掃描結果見圖2，在200～800nm之間吸光值均未超過0.2，可以說明預處理后的HPD300的有機溶劑殘留量符合國家食品藥品監督管理局的要求，可以正常使用。

圖2　預處理后HPD300的紫外光譜掃描圖（200～800nm）Fig.2　Ultraviolet spectrum scan（200～800nm）of pretreated HPD300

2.4靜態吸附動力學

按照方法1.2.5進行HPD300靜態吸附動力學實驗，得到吸附動力學曲線（圖3），HPD300對毛蕊花糖苷的吸附量隨著時間的增加而增加，在1h達到對毛蕊花糖苷的一個吸附峰值（52.93±1.20）mg/g，在3h時達到最大吸附值（59.29±1.42）mg/g，之后對毛蕊花糖苷的吸附量沒有顯著增加。

圖3　HPD300靜態吸附動力學曲線Fig.3　The adsorption kinetics curve of HPD300

擬合動力學模型的參數見表2。兩種模型的相關系數均趨近于1（R2＞0.99），說明這兩種模型都可以用來描述HPD300對毛蕊花糖苷的吸附作用，但是，準一級動力學模型中的qe更接近于實驗值。因此，HPD300對肉蓯蓉苯乙醇苷的吸附更符合準一級動力學模型。

表2　準一級動力學模型和準二級動力學模型動力學參數Table.2　Kinetic parameters of pseudo-fisrt order and pseudo-second order model

2.5吸附等溫線

為了更好地理解大孔樹脂HPD300對毛蕊花糖苷的吸附特點，采用8種不同濃度的樣品（毛蕊花糖苷的濃度0.2701～1.8909mg/mL），與HPD300混合后振蕩24h，轉速為120r/min，溫度分別為25、35、45℃，吸附平衡后，計算平衡吸附量，以初始濃度值為橫坐標，平衡吸附量為縱坐標，繪制曲線（圖4），當C0為0.28～0.97mg/mL時，隨著溫度的升高，HPD300對毛蕊花糖苷的吸附量無顯著增加（p＞0.05），當C0為1.11～1.95mg/mL時，隨著溫度的升高，HPD300對毛蕊花糖苷的吸附量顯著增加（p＜0.05）。

擬合Langmuir和Freundlich方程，參數見表3。可以看出，大孔樹脂HPD300對毛蕊花糖苷的吸附更趨近于Freundlich模型，即多分子層不均勻吸附，n值大于1，說明HPD300對毛蕊花糖苷的吸附是有利吸附[28]。

圖4　大孔吸附樹脂HPD300對毛蕊花糖苷的吸附等溫線Fig.4　Adsorption isotherms of acteoside on HPD300

表3　大孔吸附樹脂HPD300對毛蕊花糖苷的吸附等溫線參數Table.3　Adsorption isotherm parameters of acteoside on HPD300

2.6動態吸附和解吸實驗

為了降低流動相乙醇的使用量，并且更有效的完成洗脫過程，考察了不同濃度乙醇對毛蕊花糖苷的洗脫效率（圖5）。20%的乙醇開始洗脫出少量的毛蕊花糖苷，洗脫率為1.19%；隨著乙醇濃度的升高，對毛蕊花糖苷的洗脫率逐漸增加，到50%時達到最大值，達95.51%。因此，選擇20%和50%的乙醇分別進行雜質和毛蕊花糖苷的洗脫。

圖5　不同濃度的乙醇對毛蕊花糖苷的解吸率Fig.5　Desorption rates of acteoside by ethanol with different concentrations

吸附平衡后，先用超純水洗脫，之后依次用20%和50%的乙醇進行雜質和毛蕊花糖苷的洗脫，洗脫速度分別為5、10、15mL/min，洗脫曲線如圖6和圖7。

圖6　20%乙醇對毛蕊花糖苷的解吸曲線Fig.6　Desorption curves of acteoside by 20%ethanol

表4　不同流速洗脫雜質所需時間和乙醇Table.4　The needed time and quantity of ehtanol to elute impurities with different flow rates

表5　不同流速洗脫毛蕊花糖苷的比較Table.5　Compare of eluting acteoside with different flow rates

以毛蕊花糖苷的解吸率不超過2%為標準，確定雜質洗脫時間。速度不同時，洗脫雜質所需時間和乙醇量見表4，洗脫毛蕊花糖苷所需時間和乙醇量、毛蕊花糖苷的回收率和純度見表5。當流速為15mL/min時，回收率和純度降低，可能是因為流速太大，超純水已經洗脫出部分毛蕊花糖苷。因此，采用流速為10mL/min，此時進行雜質和毛蕊花糖苷的乙醇洗脫，乙醇濃度為20%和50%，洗脫時間分別為75min和60min，毛蕊花糖苷的回收率和純度分別為（68.90±1.02）%和（68.20±2.01）%。

圖7　50%乙醇對毛蕊花糖苷的解吸曲線Fig.7　Desorption curves of acteoside by 50%ethanol

3　結論與討論

本研究通過靜態實驗篩選出對管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷吸附和解吸能力最強的樹脂HPD300，并建立了HPD300純化毛蕊花糖苷的方法：吸附平衡后經超純水洗脫30min，之后依次用20%和50%的乙醇洗脫75min和60min，洗脫速度為10mL/min。

Liu等[12]采用大孔樹脂制備管花肉蓯蓉苯乙醇苷，將毛蕊花糖苷的含量提高至15.17%，回收率為90.17%；卿德剛等[15]采用大孔樹脂純化管花肉蓯蓉松果菊苷，純度和回收率分別為32.6%和91.4%。本研究經過大孔樹脂純化后，毛蕊花糖苷的回收率和純度分別為（68.90±1.02）%和（68.20±2.01）%，純度較高，但是回收率較低，原因可能是回收產物不夠細致，放棄了應該保留的部分洗脫液；產物的回收率和純度均有一定的提升空間，可以從樣品的前處理、增加待篩選大孔樹脂類型、梯度洗脫等方面進行進一步的探索，以提高毛蕊花糖苷的純度和回收率。

Li等[7]和Han等[9]采用高速逆流色譜技術進行毛蕊花糖苷的純化，純度和回收率均達到90%以上，但是該技術成本高，且純化過程使用多種有機溶劑，比如乙酸乙酯、正己烷等，均有一定的毒性，不適用于食品和保健品成分的分離純化；雷厲等[10]和任璐[11]結合柱層析和色譜技術進行毛蕊花糖苷和松果菊苷的純化，產物的純度和回收率均達到90%以上，但是純化過程復雜，需要反復過柱，也需要使用多種有機溶劑，同樣不適合分離純化食品和保健品成分。本研究采用的大孔樹脂吸附技術，只使用乙醇一種有機溶劑，該溶劑無毒性，適用于保健品和食品成分的分離純化；且大孔樹脂的成本低，可以重復使用，適用于工業化生產。

[1]Xiong W T，Gu L，Wang C，et al.Anti-hyperglycemic and hypolipidemic effects of Cistanche tubulosa in type 2 diabetic db/db mice[J].Journal of Ethnopharmacology，2013，150（3）：935-945.

[2]Di Giancamillo A，Rossi R，Vitari F，et al.Changes in nitrosative stress biomarkers in swine intestine following dietary intervention with verbascoside[J].Histol Histopathol，2013，28（6）：715-723.

[3]Esposito E，Mazzon E，Paterniti I，et al.PPAR-α Contributes to the Anti-Inflammatory Activity of Verbascoside in a Model of Inflammatory Bowel Disease in Mice[J].PPAR Research，2010，2010：1-10.

[4]Rossi R，Ratti S，Pastorelli G，et al.The effect of dietary vitamin E and verbascoside on meat quality and oxidative stability of Longissimus Dorsi muscle in medium-heavy pigs[J].Food Research International，2014.

[5]Casamassima D，Palazzo M，Martemucci G，et al.Effects of verbascoside on plasma oxidative status and blood and milk production parameters during the peripartum period in Lacaune ewes[J].Small Ruminant Research，2012，105（1-3）：1-8.

[6]Funes L，Laporta O，Cerdán-Calero M，et al.Effects of verbascoside，a phenylpropanoid glycoside from lemon verbena，on phospholipid model membranes[J].Chemistry and Physics of Lipids，2010，163（2）：190-199.

[7]Li L，Tsao R，Liu Z Q，et al.Isolation and purification of acteosideandisoacteosidefrom Plantago psyllium L.by high-speed counter-current chromatography[J].Journal of chromatography A，2005，1063（1）：161-169.

[8]Li L，Liu C M，Liu Z Q，et al.Isolation and purification of phenylethanoid glycosides from plant extract of Plantago asiatica by high performance centrifugal partition chromatography[J]. Chinese Chemical Letters，2008，19（11）：1349-1352.

[9]Han L F，Ji L N，Boakye-Yiadom M，et al.Preparative isolation and purification of four compounds from Cistanches deserticola YC Ma by high-speed counter-current chromatography [J].Molecules，2012，17（7）：8276-8284.

[10]雷厲，宋志宏，屠鵬飛，等.反相高效液相色譜法制備松果菊苷標準品[J].色譜，2001，19（3）：200-202.

[11]任璐.栽培管花肉蓯蓉中苯乙醇苷的提取與純化研究[D].無錫：江南大學，2006.

[12]Liu B Y，Ouyang J，Yuan X F，et al.Adsorption properties and preparative separation of phenylethanoid glycosides from Cistanche deserticola by use of macroporous resins[J].Journal of Chromatography B，2013，937：84-90.

[13]陳新萍，代冬覺，羅鋒，等.大孔樹脂對管花肉蓯蓉2種苷類靜態吸附分離特性研究[J].河南農業科學，2011（3）：115-118.

[14]任璐，顧小紅，陶冠軍，等.大孔樹脂對管花肉蓯蓉中苯乙醇苷的吸附分離特性研究[J].食品科學，2005，26（8）：327-331.

[15]卿德剛，張娟，吳濤，等.大孔樹脂對管花肉蓯蓉中松果菊苷的純化工藝研究[J].中國中醫藥科技，2011，18（1）：41-42. [16]賈寶國.松果菊苷和毛蕊花糖苷分離純化及其影響因素的研究[D].廣州：中山大學，2010.

[17]Lin L H，Zhao H F，Dong Y，et al.Macroporous resin purification behavior of phenolics and rosmarinic acid from Rabdosia serra（MAXIM.）HARA leaf[J].Food Chemistry，2012，130（2）：417-424.

[18]鄧亮，葉利明，侯世祥，等.苯乙烯型大孔吸附樹脂預處理的質量評價方法研究[J].中國中藥雜志，2004，29（11）：1037-1040.

[19]賈存勤，李陽春，屠鵬飛，等.HPD系列大孔吸附樹脂預處理方法研究[J].中國中藥雜志，2005，30（18）：1425.

[20]Mathews D H，Sabina J，Zuker M，et al.Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure[J].J Mol Biol，1999，288（5）：911-940.

[21]Guibal E，Milot C，Tobin J M.Metal-Anion Sorption by Chitosan Beads：Equilibrium and Kinetic Studies[J].Industrial& Engineering Chemistry Research，1998，37（4）：1454-1463.

[22]Ho Y S，Mckay G.Pseudo-second order model for sorption processes[J].Process Biochemistry，1999，34（5）：451-465.

[23]Bhattacharya A K，Venkobachar C.Removal of cadmium（II）by low cost adsorbents[J].Journal of Environmental Engineering，1984，110（1）：110-122.

[24]Liu J，Luo J G，Sun Y，et al.A simple method for the simultaneous decoloration and deproteinization of crude levan extract from Paenibacillus polymyxa EJS-3 by macroporous resin [J].Bioresource Technology，2010，101（15）：6077-6083.

[25]Ma C Y，Tao G J，Jian T，et al.Preparative separation and purification of rosavin in Rhodiola rosea by macroporous adsorption resins[J].Separation and Purification Technology，2009，69（1）：22-28.

[26]袁鑄人，郭立瑋，彭國平，等.氣相色譜法檢測AB-8大孔吸附樹脂殘留物及醋酸纖維素膜截留殘留物的研究[J].南京中醫藥大學學報：自然科學版，2002（2）：96-97.

[27]凌寧生，劉志青，李林，等.中藥用D-101型大孔樹脂苯系列殘留物分析研究[J].中草藥，2002（2）：28-30.

[28]Liu Y Z，Bai Q Q，Lou S，et al.Adsorption Characteristics of（-）-Epigallocatechin Gallate and Caffeine in the Extract of Waste Tea on Macroporous Adsorption Resins Functionalized with Chloromethyl，Amino，and Phenylamino Groups[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（6）：1555-1566.

Study on purifying acteoside from Cistanche tubulosa by macroporous resin

The purpose of this paper was to explore method for purifying acteoside from Cistanche tubulosa by using macroporous resin.The most suitable resin was decided by static tests and then three parameters including eluent concentration，eluting time and eluting rate were optimized for developing dynamic eluting conditions.Results showed that resin HPD300 had the best absorption and desorption capabilities.The content of acteoside increased from 5.26%to 68.20%with recovery of 68.90%under the optimized dynamic eluting conditions——eluting with ultrapure water for 30min after saturation adsorption，then with 20%and 50%ethanol for respectively 75min and 60min with flow rate 10mL/min.The method developed provided a potential approach for industrial production of acteoside from Cistanche tubulosa for its relative high recovery and purity and low cost.

Cistanche tubulosa；acteoside；macroporous resin；purify

TS255.1

B

1002-0306（2015）04-0269-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.050

2014－07－31

顧云（1990-），女，碩士研究生，研究方向：微生物藥物工程與生物技術。

劉昕（1957-），男，碩士，教授，研究方向：生物技術。