Box-behnken設計優化玉米須黃酮純化工藝研究

郭志紅，周鴻立，郭向明

（1.吉林大學化學學院，吉林長春130012；2.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022）

Box-behnken設計優化玉米須黃酮純化工藝研究

郭志紅1，2，周鴻立2，*，郭向明2

（1.吉林大學化學學院，吉林長春130012；2.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022）

以玉米須總黃酮回收率作為考察指標，用AB-8大孔樹脂進行純化，在單因素實驗基礎上，采用Box-behnken設計優化洗脫條件，確定最佳純化條件為：上樣濃度為2mg/mL，上樣速度為1mL/min，上樣量為55mL，吸附時間2h，用乙醇濃度70%，乙醇體積4BV，洗脫速率為1.8mL/min，在最佳工藝條件下玉米須總黃酮回收率可達80.68%，玉米須粗提物中總黃酮含量由純化前的4.15%提高到25.68%。實驗說明，該法操作簡單、方便、便于工業化生產。

玉米須黃酮，AB-8大孔樹脂，Box-behnken設計，回收率

玉米須（Zea mays L.）為禾本科玉蜀黍屬植物玉米的花柱和柱頭，含有黃酮類、多糖類、皂甙、生物堿、單寧酸、綠原酸、蛋白質、揮發性油和類固醇[1-2]等多種生物活性成分。黃酮類成分有降壓、降血脂、增加冠脈流量、強心、抗心律不齊等藥理作用[3]。因此對玉米須黃酮純化研究很有必要。

大孔吸附樹脂是近年來發展起來的一類有機高分子聚合物吸附劑，其具有物理化學穩定性好、工藝簡單、吸附容量大、速度快、再生簡便、使用周期長、機械強度高等諸多優點[4]，廣泛用于天然產物的純化。Box-behnken設計——響應曲面法（response surface methodology，RSM）是一種應用較廣的實驗優化方法，由于采用了更為合理的實驗設計，通過多項式模型有效快速地確定多因子系統的最佳條件[5]。目前響應面法已廣泛用于天然產物的提取過程，有關應用于黃酮類純化的報道較少，目前筆者只見響應面法純化刺山柑葉黃酮[6]、枳實總黃酮[7]、苦蕎黃酮[8]的相關報道，未見應用于大孔樹脂純化玉米須黃酮的工藝。本文中用AB-8大孔樹脂純化玉米須粗黃酮，采用Box-Behnken設計方法，探索研究最佳的洗脫工藝，為玉米須黃酮的精制提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

玉米須玉米須藥材2012采自吉林省吉林市郊區，由吉林大學王廣樹教授鑒定為甜粘1號；蘆丁對照品0080-9705，純度＞98%，中國藥品生物制品檢定所；AB-8大孔樹脂天津南開大學化工廠；實驗用水為蒸餾水；無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、無水三氯化鋁均為分析純。

752紫外可見分光光度計上海菁華科技儀器有限公司；FA1004電子天平上海菁海儀器有限公司；層析柱（18mm×200mm） 上海天玻儀器；GZXGW·2-BS高溫干燥箱上海博泰實驗設備有限公司；PHS-3C數字式酸度計上海理達儀器廠；SHB-ⅢA循環水式多用真空泵鄭州長城科工貿有限公司；RE-52A旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠；KQ2500B超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品的處理與制備玉米須清洗去塵，晾干，粉碎，過篩（60目）后，稱取300g玉米須粉末，放入大燒瓶中，按料液比1∶25的比例加入60%的乙醇，80℃下提取2h，重復兩次，過濾，合并濾液，濃縮，用60%的乙醇定容到1000mL容量瓶，備用。

1.2.2黃酮的含量測定以蘆丁為對照品，采用三氯化鋁顯色法測定玉米須黃酮[9]。得回歸方程為：y=24.834x+0.0071，r2=0.9995，黃酮質量濃度在10～30μg/mL呈良好的線性關系。

1.2.3單因素實驗

1.2.3.1上樣液pH對吸附性能的影響將玉米須總黃酮濃度為1.2mg/mL的玉米須黃酮上樣液用5%鹽酸和2%的NaOH溶液調成pH=3、4、5（原液5.4）、6、7、8、9，分別取20mL于250mL的裝有2g預處理后樹脂的三角燒瓶中，封口，置于恒溫水浴搖床中振搖24h，充分吸附后，靜止2h，過濾，測定濾液的濃度，計算吸附率。吸附率Q=（C0－Ct）Vy/C0Vy

式中，C0為樣液的初始質量濃度，Ct為吸附后樣液質量濃度，Vy為樣液體積。

1.2.3.2上樣濃度對總黃酮回收率的影響以篩選出的AB-8型大孔樹脂為玉米須總黃酮的純化載體，采用濕法裝柱。裝柱高度為10cm，即1BV（柱床體積）約為20mL。取總黃酮濃度為0.52、1.03、1.58、2.04、2.81mg/mL的樣液各40mL，以1.5mL/min的流速，分別加入5根同樣的樹脂柱中。吸附完全后，用去離子水沖至流出液無色，再用濃度70%乙醇洗脫，乙醇用量為4BV，測定回收率，選擇最適上樣濃度。

回收率（%）=乙醇洗脫所得總黃酮的質量/上樣前總黃酮的質量×100

1.2.3.3上樣量的確定將提取液總黃酮稀釋為濃度2.07mg/mL的樣液若干，量取10mL已處理好的樹脂裝于層析柱（1.8mm×200mm）中，以1mL/min的速度上樣，每5mL為一個收集段，檢測每段收集液中總黃酮濃度。當流出液的濃度達到初始濃度的1/10時，即可認為樹脂已吸附飽和。

1.2.3.4上樣速率對總黃酮回收率的影響取總黃酮濃度為2mg/mL的樣液5份，每份40mL。分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL/min的流速加入到5根同樣的樹脂柱中。吸附完全后（大約2h），用去離子水沖洗至流出液無色，再用濃度70%乙醇洗脫，乙醇用量為4BV，測定回收率，選擇最適合上樣速率。

1.2.3.5吸附時間對總黃酮回收率的影響取5根相同的玻璃層析柱（18mm×200mm），5份相同體積的已處理好的樹脂20mL，濕法裝柱，總黃酮濃度為2.0mg/mL的溶液5份，每份40mL，上樣，上樣速度1mL/min，上樣后分別吸附1、2、3、4、5h后，水洗至流出液無明顯顏色，分別加入70%的乙醇80mL，洗脫速度為1.5mL/min，測洗脫液濃度，計算回收率。

1.2.3.6乙醇洗脫濃度對總黃酮回收率的影響取20mL飽和吸附的AB-8樹脂五份，裝入相同型號的五根層析柱，先用去離子水沖洗至流出液無色，再分別用濃度40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液進行洗脫，洗脫速率為2mL/min，乙醇用量為4BV，測定其回收率，選擇最適洗脫濃度。

1.2.3.7洗脫速率對總黃酮回收率的影響取20mL飽和吸附的AB-8樹脂五份，裝入相同型號的五根層析柱，先用去離子水沖洗至流出液無色，然后用濃度70%的乙醇溶液分別以1、2、3、4mL/min的速率進行洗脫，乙醇用量為4BV，測定其回收率，選擇最適洗脫速率。

1.2.3.8洗脫劑體積的考察取按上述條件吸附后的AB-8大孔樹脂20mL，用純化水洗脫至無明顯顏色，再用70%乙醇洗脫，流速為2mL/min，每5mL收集一次洗脫液，檢測洗脫液中玉米須總黃酮濃度。

1.2.3.9響應面實驗設計根據Box-Behnken實驗設計原理，在單因素實驗基礎上，共設計17個實驗點，12個分析點，5個零點以估計誤差，每次精密量取20mL吸附飽和的大孔樹脂進行實驗，選用對解析率影響較大洗脫劑濃度X1、洗脫速率X2和洗脫劑用量X3為變量，以玉米須總黃酮回收率為響應值（R），進行響應面分析實驗。實驗設計表1。

表1　響應面實驗因素水平表Table.1　Factors and levels of RSM

1.3數據處理

按照表1的設計方案，利用Design-Expertv8.0.5軟件，采用Box-Behnken設計、二項式模型進行回歸分析。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1上樣液pH對吸附性能的影響當pH=3、4時，溶液中出現磚紅色沉淀，可能是黃酮類物質生成烊鹽，導致吸附效果變差。當pH=9時，溶液部分變綠色，導致黃酮類物質變質，影響吸附效果，在pH5.0時，黃酮類化合物最適宜被該樹脂吸附。這可能是由于在此條件下，黃酮類物質呈分子狀態，不生成烊鹽，以氫鍵方式被吸附[7]，因而樹脂吸附量大，吸附率也高。因此，原液（pH=5.3）不需要調節pH，可直接使用。

圖1　pH對總黃酮吸附率影響Fig.1　Effect of pH values on the adsorption efficiency

2.1.2上樣濃度對總黃酮回收率的影響從圖2可以看出，當上樣液濃度為0.5mg/mL時，樹脂對黃酮液的吸附率達到最大，此時上樣量較少，絕大部分黃酮都被吸附，樹脂未飽和，當用蒸餾水洗樹脂時，只有少數黃酮洗出，損失量少，回收率大，隨濃度的增加上樣量增加吸附量逐漸增大，當樹脂完全飽和時，吸附量不再變化，相應的黃酮就有損失，上樣量越大水洗時損失越大，在2mg/mL左右時回收率達到最大，為了充分利用樹脂，將濃度為2mg/mL的溶液作為上樣液的最佳濃度。

圖2　上樣濃度對回收率的影響Fig.2　Effect of sample concentration on recovery efficiency

2.1.3上樣量的確定實驗以流出黃酮濃度為上樣液的10%時為泄露點，根據圖3可知當上樣55mL時達到泄露點，吸附量為105mg，當上樣為160mL時接近上樣液濃度，上樣量為此時可確定為上樣體積為55mL，約為3BV。

圖3　上樣量對吸附效果的影響Fig.3　Effect of sample loading amount on the recovery efficiency

2.1.4上樣速率對總黃酮回收率的影響從圖4可知，當上樣速度為0.5mL/min時黃酮的回收率最大，隨著上樣速度的增大，回收率逐漸減小，原因可能是樹脂的內擴散速率與上樣液流速的反比關系[10]。上樣液流速過快，總黃酮未進行徹底吸附就已經發生泄漏。但當速度為1mL/min時，回收率與最大值相差不大，為了節省時間，選擇1mL/min作為最佳的上樣速度。

2.1.5吸附時間的對總黃酮回收率的影響從圖5中可以看出，在2h內由于吸附時間短，黃酮分子未與樹脂完全吸附，水洗時會帶走一部分未被吸附的黃酮，回收率較低，隨著時間的增加，黃酮分子逐漸被吸附完全，2h時達到最大值，吸附時間超過2h后，由于吸附時間過長會有一部分雜質也被吸附，黃酮分子與樹脂間形成死吸附，回收率逐漸下降，因此最佳吸附時間為2h。

2.1.6乙醇洗脫濃度對總黃酮回收率的影響從圖6中可知看出，總黃酮的回收率隨著乙醇濃度的增大而呈上升趨勢，體積分數在70.0%時達到最大，之后略顯下降。不同濃度的乙醇的極性不同，隨著乙醇濃度的增大極性逐漸減小，在40%的乙醇洗脫時包括多糖類的大分子物質組分先流出，雜質較多，在70%時黃酮類物質基本被洗脫，90%時極性小，洗脫物質大多為苷元類物質，因此選擇70%的乙醇為洗脫溶劑。

圖4　上樣速度對回收率的影響Fig.4　Effect of loading flow rate on the recovery efficiency

圖5　吸附時間對回收率的影響Fig.5　Effect of adsorption time on the recovery efficiency

圖6　乙醇濃度對回收率的影響Fig.6　Effect of different ethanol concentration on recovery efficiency

2.1.7洗脫速率對總黃酮回收率的影響從圖7中可以看出，隨著乙醇流速增大回收率降低，這是因為在乙醇體積相同的情況下，乙醇流速太大，洗脫劑還未充分洗脫樹脂上吸附的黃酮就已經流出柱外，因此洗脫流速應比較小，但流速過低將導致整個洗脫過程時間變長，生產周期延長。從圖7中可以看出，當洗脫速率1.0mL/min時洗脫效果最好，而在洗脫流速1.0～2.0mL/min之間下降趨勢不明顯，綜合考慮解吸率及時間后洗脫流速應選擇在1.0～2.0mL/min之間。

圖7　洗脫速率對回收率的影響Fig.7　Effect of different velocity of ethanol on recovery efficiency

2.1.8洗脫劑體積的考察從圖8中可以看出，洗脫液中總黃酮濃度隨洗脫液用量增大而升高，之后又隨之降低，大約在第15個組分時，黃酮的含量相對較少，因此3.5BV體積的洗脫液就可以基本將總黃酮洗脫干凈。

圖8　乙醇用量的考察Fig.8　Investigation on the amount of ethanol

2.2Box-Behnken實驗設計與結果

采用Design-expertv 8.0.5軟件進行實驗設計和結果分析，結果見表2。

表2　總黃酮解吸條件的優化實驗設計及結果Table.2　Optimization of desorption conditions and results of experimental design

通過對實驗結果進行響應面分析，經過二次回歸擬合后，得出擬合方程式：

R1（%）=76.65-1.88X1-2.07X2+5.05X3+0.86X1X2-0.49X1X3-0.46X2X3-0.96X12-8.24X22-2.29X32

表3　方差分析表Table.3　ANOVA of regression analysis

表3中對回歸方程進行方差分析，可以看出模型的p＜0.001，證明實驗所選用的二次多項模型具有極顯著性，且失擬項的p＞0.05，表明失擬項不顯著；其校正系數R2=0.9584，表明模型充分擬合實驗數據，因此可以用此模型來分析和預測純化黃酮的工藝[11]。在總的作用因素中，X3、X22、X32項的對響應值Y影響是極顯著的（p＜0.01），X1、X2項的影響是顯著的（p＜0.05），而方程的交互項X1X2、X1X3、X2X3對Y影響不顯著（p＞0.05）。

2.3響應面圖分析

結合Box-Behnken實驗設計方案，利用RSM研究各個因素之間對總黃酮回收率的影響，做出響應面圖，以洗脫劑濃度、洗脫速率與洗脫劑用量的交互作用對總黃酮的回收率的影響，根據回歸方程得出不同因子的響應面分析圖及相應等值線圖結果見圖9。

圖9　兩因素交互作用對總黃酮得率的響應面圖和等高線圖Fig.9　Response surface and contour plots for the effect of operating parameters on the recovery efficiency of total flavonoids

從響應面分析圖上可較直觀地看出各因素交互作用對響應值的影響。響應面中，若響應曲面很平滑，則交互作用對響應值的影響不顯著，若曲面陡峭則交互作用影響顯著。等高線圖中，等高線的密度越大，表示條件的變化對響應值的影響越顯著。等高線為橢圓形表示交互作用影響顯著，為圓形時影響則不顯著[12]，從圖9可知，三種因素的交互作用不顯著，表現為曲線平滑。

圖9（a）中，洗脫劑體積對響應值影響顯著，表現為曲線較陡。由交互作用的等高線可知，沿洗脫體積軸向等高線密集，而速度軸向等高線相對稀疏，說明洗脫體積對響應值峰值的影響比速度大。曲面中心值并不是曲面最大值，隨著洗脫體積的增大而增大，在4BV時達到最大值，說明此時為最優的工藝。圖9（b）中，洗脫劑濃度對響應值影響不顯著，表現為曲面平緩，濃度軸線等高線稀疏，濃度軸向曲線變化不大，曲面最大值對應的洗脫劑濃度在零水平處，可判斷此時為最佳洗脫劑濃度。圖9（c）中響應值隨洗脫速度呈現由低到高再降低的趨勢，即響應值在零水平處具有極大值。

可推斷對響應值的影響順序為：洗脫劑體積＞洗脫速度＞洗脫劑濃度，這基本和方差分析結果一致。可通過軟件對模型極值求解和分析等高線得到最佳洗脫條件：洗脫劑濃度70%，洗脫速率1.79mL/min，洗脫劑體積4BV。

2.4驗證實驗

為檢驗RSM分析法的可靠性，采用上述最優提取條件進行黃酮的分離純化實驗，同時考慮到實際操作的便利，將洗脫的最佳條件修正為：洗脫速率1.80mL/min，洗脫劑濃度為70%，洗脫劑用量為4BV，理論上總黃酮回收率值可達81.19%，實際得到大孔樹脂解析玉米須黃酮類化合物的平均回收率為80.68%，與理論值較為穩合，粗黃酮的純度由原來的4.15%提高到25.68%，提高了6.12倍，表明優選工藝提取效果較為理想性。

3　結論

3.1AB-8大孔吸附樹脂用于玉米須黃酮的分離純化，除去了大量色素、多糖、蛋白質等物質，省去了傳統溶劑萃取法的繁瑣工藝，僅吸附-洗脫一步工藝即得到高含量的玉米須總黃酮，且收效高、成本低、操作簡便，適于工業化規模生產。

3.2在單因素的基礎上用響應面法優化玉米須粗黃酮的純化工藝，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過回歸方程得到最優工藝：上樣濃度2mg/mL，上樣速度為1mL/min，上樣量為55mL，吸附時間2h，洗脫劑乙醇濃度70%，乙醇體積4BV，洗脫速率為1.80mL/min，在最佳工藝條件下玉米須總黃酮回收率可達80.68%，本研究為工業純化玉米須黃酮提供了依據。但本實驗僅對解析過程進行了優化，吸附過程的優化還需進一步探索。

[1]HU QL，DENG ZH.Protective effects of flavonoids from corn silk on oxidative stress induced by exhaustive exercise in mice [J].African Journal of Biotechnology，2011，10（16）：3163-3167.

[2]HU QL，ZHANG LJ，Li YN，et al.Purification and anti-fatigue activity of flavonoids from corn silk[J].International Journal of Physical Sciences，2010，5（4）：321-326.

[3]方敏，占才貴，宮智勇.玉米須總黃酮的提取與抗氧化活性研究[J].食品科學，2009，30（18）：206-208.

[4]FU B，LIU J，LI H，et al.The application of macroporous resins in the seperation of licorice flavonoids and glycyrrhizic acid[J]. Journal of Chromatography A，2005，1089（1-2）：18-24.

[5]Qian Xu，Yanyan Shen，Haifeng Wang，et al.Application of response surface methodology to optimise extraction of flavonoids from fructus sophorae[J].Food Chemistry，2013（138）：2122-2129.

[6]李國慶，李佳，顧晶晶，等.相應面法純化柑葉黃酮的研究[J].中成藥，2009，31（9）：1363-1367.

[7]馬麗，陳家儀，陳稚.星點設計-響應面法優選枳實總黃酮的大孔吸附樹脂純化工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（8）：34-37.

[8]于智峰.苦蕎黃酮大孔樹脂精制工藝及抗氧化特性研究[D].西安：西北農林科技大學，2007.

[9]Jun Liu，Songyi Lin，Zuozhao Wang.Supercritical fluid extraction of flavonoids from Maydisstigma and its nitritescavenging ability[J].Food and Bioproducts Processing，2011，89：333-339.

[10]景怡，景榮琴，任遠.AB-8大孔吸附樹脂分離純化玉米須中總黃酮的研究[J].中醫藥學報，2010，38（1）：75-78.

[11]鄒建國，劉飛，劉燕燕，等.響應面法優化微波輔助提取枳殼中總黃酮工藝[J].食品科學，2012，33（2）：24-28.

[12]Li Yang，Ya-Lan Cao，Jian-Guo Jiang.Response surface optimization of ultrasound-assisted flavonoids extraction from the flower of Citrus aurantium L.Var.amara Engl[J].J Sep Sci，2010，33：1349-1355.

Study on purification of total flavonoids of corn silk with the Box-behnken design

GUO Zhi-hong1，2，ZHOU Hong-li2，*，GUO Xiang-ming2
（1.College of Chemistry，Jilin University，Changchun 130012，China；2.College of Chemical and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China）

To optimize the purification of total flavonoids of corn silk，AB-8 macroporous resin was carried out by response surface methodology in this study.Total flavonoids elution rate of corn silk as the indexes，on the basis of single-factor experiments，Box-behnken design was used to explore the optimal conditions.The optimal refined conditions were as follows：55mL sample volume，the velocity of sample solution 1mL/min，2mg/mL sample concentration，adsorption time 2h，4BV of 70%ethanol，elution velocity 1.8mL/min.The recovery efficiency of total flavonoids was up to 80.68%.The purity of total flavonoids increased from 4.15%to 25.68%.Results indicated that the method was simple，convenient，easy to industrial production.

flavonoids of corn silk；AB-8 macroporous resin；Box-behnken design；recovery efficiency

TS201.1

B

1002-0306（2015）04-0260-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.048

2014－07－03

郭志紅（1987-），女，在讀碩士研究生，研究方向：有機分析化學。

周鴻立（1967-），女，博士，教授，研究方向：天然產物的研究與開發。

吉林省科技廳科研項目（20130303050NY）；吉林省教育廳2013第319號。