從富油新綠藻提取葉綠素的研究

李燦良，鐘　敏，胡雪瓊，李雁群

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東湛江524088）

從富油新綠藻提取葉綠素的研究

李燦良，鐘敏，胡雪瓊，李雁群*

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東湛江524088）

為了探討利用微藻生產天然食用色素葉綠素可能性及其工藝條件，以富油新綠藻為研究對象，首先研究通過提高培養基氮源含量來提高藻細胞葉綠素含量，然后針對提取溶劑配方、提取劑的用量、提取時間、提取溫度等工藝條件進行實驗，分析提取工藝參數對葉綠素提取效果的影響，對超聲波輔助提取做了探討，最后通過正交實驗對提取條件進行了優化。結果表明，丙酮∶乙醇＝1∶3的混合溶劑、溶劑用量為鮮藻泥質量的8倍、提取溫度45℃、提取時間8h的工藝條件可以獲得滿意的提取效果。實驗表明，在本文的微藻培養條件和優化的葉綠素提取條件下，富油新綠藻的葉綠素提取率可以達到53.69mg/g（藻干物質），實驗結果還表明超聲波處理對于富油新綠藻的葉綠素提取沒有促進作用。

綠藻，富油新綠藻，葉綠素

葉綠素是脂溶性卟啉類化合物，色澤鮮艷，是所有綠色植物的基本化學物質，是優質、食用安全的天然色素，廣泛應用于食品、醫藥和日用化學工業[1-2]。目前，葉綠素主要從竹葉、苧麻葉、蠶砂等原料中提取。由于綠色素的需求量大，葉綠素的生產量不能滿足對綠色素的市場需求，許多食品和藥品仍然還在使用化學合成的綠色素。因此，開發葉綠素的生產原料、增加葉綠素的供應具有重要的現實意義。

近年來，微藻在能源、食品等多方面應用的研究廣泛開展起來[3-4]。綠藻門微藻大多葉綠素含量高，因此，利用微藻生產葉綠素將具有良好的前景。不僅如此，在利用微藻作為油脂和蛋白質資源方面，如果能在生產中先提取葉綠素，可以增加微藻的價值，降低微藻在食品、化工、能源等領域應用的成本，增加收益[5]。

在傳統的以高等植物葉子或蠶沙為原料的葉綠素提取工藝中，一般用丙酮、甲醇、乙醇等溶劑，或者用這些溶劑的混合溶劑為提取劑[6-8]，這種工藝提取設備較為簡單、操作容易、設備投入相對較低、生產能力也較大，所以得到廣泛的采用。此外，一些新工藝也逐步得到關注，如超臨界CO2提取工藝[9-10]、超聲波輔助提取技術也被應用到葉綠素的提取工藝中[11]。但是，超臨界CO2工藝要求材料必須先經過干燥，而葉綠素是熱敏性色素，因此只能采用諸如冷凍干燥等低溫干燥工藝，這必然大幅度增加生產成本。超聲波輔助有助于提取過程中的質量傳遞，特別是有利于葉綠素從大尺寸的顆粒材料中提取出來，但是，大規模工業化超聲波輔助設備除了設備復雜以外，存在超聲波在物料中的傳遞障礙和梯度分布容易造成局部過熱等問題，所以其在葉綠素等熱敏性成分提取中的應用也受到一定的影響。從微藻中提取葉綠素作為食品添加劑的研究少有報道，以綠藻為原料生產的葉綠素也尚未見上市。富油新綠藻是綠藻門微藻，在國外用來作為鮑魚飼料，具有食用安全性的潛力，葉綠素含量高，近幾年本實驗室利用其高產油脂能力開展研究，然而，在油脂提取之前提取葉綠素，充分利用資源，提高微藻原料的附加值具有重要意義。微藻作為單細胞生物，與高等植物有所不同。微藻和高等植物的細胞壁結構有較大的差異，在其材料的顆粒大小和混合流動狀態以及溶劑的滲透性等方面都有自身的特點。因此，從微藻中提取葉綠素與傳統工藝中有何差異，值得研究。本文擬研究從富油新綠藻中提取葉綠素的工藝條件，比較溶劑、溫度、提取時間、超聲波等工藝條件對提取效率的影響，以期為開發利用微藻生產葉綠素的工藝提供參考數據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

藻種富油新綠藻Neochloris oleoabundans，從美國德克薩斯大學（奧斯丁）藻種保存中心引入，本實驗室保存；丙酮、無水乙醇、95%乙醇、NaNO3、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、FeCl3均為分析純，購自湛江市林達化學試劑公司。

TDL-5-A型低速臺式離心機上海安亭科學儀器廠；WFJ 7200型可見分光光度計尤尼柯上海儀器有限公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋上海-恒科學儀器有限公司；QHZ-98B型全溫度光照振蕩培養箱太倉市華美生化儀器廠；98-2型磁力攪拌器上海司樂儀器有限公司；FA1004型精密電子天平等。

1.2實驗方法

1.2.1藻細胞收獲富油新綠藻接種于裝有1000mL改良SE培養基的大錐形瓶中培養，通入含5%CO2的空氣、連續光照、用磁力攪拌器攪拌，在室內通過空調、通風和取暖器調節室溫使培養液溫度穩定在28～30℃，培養7d，將微藻培養液在3300×g離心10min，傾去上清液，得到濕藻細胞（簡稱藻泥）作為原材料用于葉綠素提取實驗。

1.2.2藻生物量測定藻培養液或藻泥懸浮液中藻生物量的測定采用參考文獻[12]的方法，即先將樣品適當稀釋，再測600nm波長下的光密度OD600，以OD600× 0.4之積為細胞生物量（g/L，細胞干物質質量）。

1.2.3葉綠素提取直接測定微藻培養液中的葉綠素含量的方法，取微藻培養液2mL于離心管中，3300×g離心10min，棄上清得微藻細胞，加2mL丙酮，振蕩混勻，在4～10℃放置24h，3300×g離心10min，上清液即為葉綠素提取液，用于葉綠素含量測定；

葉綠素提取條件實驗中葉綠素含量測定方法，稱取一定質量的藻泥于提取容器中（離心管或三角瓶），添加提取劑（提取劑的配方和用量按照設計的實驗條件定）制成懸浮液，在設定溫度下振蕩浸提一定時間，取懸浮液于離心機中3300×g離心10min，取上清液即為葉綠素提取液，用于葉綠素含量測定。

1.2.4葉綠素含量測定葉綠素提取液分別在663、645nm測定光密度值，提取液中葉綠素含量按Becker的方法計算[13]。

葉綠素含量（mg/L）=20.21×OD645+8.02×OD663

式中：OD645—提取液在波長645nm時的光密度；OD663—提取液在波長663nm時的光密度。

1.2.5培養基氮源量對綠藻細胞中葉綠素含量的影響用改良的SE培養基，其中氮源（NaNO3）含量分別為10、20、25、30mmol/L，在1000mL三角瓶中裝液量為800mL，控制室溫以維持培養液溫度在28～30℃，以1vvm的流量通入含5%（v/v）CO2的空氣，5000lux強度的人工燈光連續光照，磁力攪拌，每天按照1.2.2測培養液中藻的生物量并按照1.2.3和1.2.4的方法測葉綠素含量。

1.2.6不同提取劑配方對葉綠素提取效果的影響先按照表1配制提取劑，然后各稱取1.00g藻泥，加30mL表1中相應提取劑，置于50mL離心管中，在30℃恒溫箱中振蕩浸提，在2、4、6、12、24h分別取樣2mL，離心，取上清液測OD663和OD645，計算提取液中的葉綠素含量。

表1　提取劑配方Table.1　The formulas of extraction solvents

1.2.7提取劑用量對提取葉綠素效果影響各稱取1.00g藻泥，分別按藻泥質量（g）∶提取液體積（mL）為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30的提取劑用量添加前步實驗得出的最好配方的提取劑，置于40mL離心管中，在30℃恒溫箱中振蕩浸提12h，取懸液2mL，離心，取上清液測葉綠素含量。

1.2.8提取溫度對葉綠素提取效果影響按照上兩步實驗優化的提取劑配方、提取劑用量，取1.00g藻泥加提取劑，分別在20、30、40、50、60℃條件下提取12h，測量提取液葉綠素。

1.2.9超聲波處理對葉綠素提取效果影響分別取200mg藻泥置于4個5mL容積的薄壁離心管中，加1mL提取劑，在冰浴中，進行超聲波處理，處理時間分別為10、30、45、60min，然后按照優化的提取劑、提取劑用量和提取溫度提取12h，測量提取液的葉綠素含量。

1.2.10正交設計實驗采用4因素3水平（L34）正交設計表，對提取溫度、提取劑用量和提取時間的參數做進一步優化，實驗的因素和水平安排如表2所示，按照正交表安排實驗，每組實驗做3個重復，用重復實驗數據的平均值進行統計分析。

表2　正交設計因素水平表Table.2　The factors and levels in the orthogonal design

2　結果與討論

2.1培養基氮源量對綠藻細胞中葉綠素含量的影響

培養基氮源含量對細胞生物量的影響結果如圖1所示，在微藻的培養過程中藻細胞的生物量變化符合單細胞微生物生長規律，氮源含量的高低影響了微藻生長的進程，但是在第7d藻生物量基本相同，總生物量沒有隨氮源量的不同而變化，這表明在實驗的濃度范圍內氮源是足夠的，而其他營養素的不足限制了生物量的增長。

圖1　在不同含氮培養基中細胞生物量隨培養時間的增長Fig.1　The biomass increased with cultivation time in the medium congtaining different nitrogen concentration

氮源含量對細胞葉綠素含量的影響實驗結果見圖2，從圖中可見10～25mmol/L之間氮源濃度增加提高了葉綠素含量，在25mmol/L的氮源濃度條件下葉綠素含量達到最大，而30mmol/L的氮源濃度條件下細胞的葉綠素含量反低于25mmol/L。參考文獻[12]的結果表明，在3～20mmol/L的氮源濃度范圍內，隨著氮源濃度的增加藻細胞的葉綠素含量也增加。結合圖2所示的結果和文獻結果，說明可以將氮源濃度進一步提高到25mmol/L以提高藻細胞的葉綠素含量。綠藻作為靠葉綠素進行光合作用的單細胞植物，可期望用于生產葉綠素。在作為能源、飼料等用途的培養中可以兼顧葉綠素的生產來選用培養基配方或培養條件。

圖2　在不同含氮培養基中細胞中葉綠素的含量隨培養時間的變化Fig.2　The cell chlorophyll content varied with cultivation time in the medium congtaining different nitrogen concentration

2.2提取劑配方對葉綠素提取效果的影響

提取劑配方對葉綠素提取效果的影響實驗結果如表3所示。葉綠素為脂溶性色素，提取劑的極性對提取效率有很大影響。實驗所用的提取劑配方不同，提取劑的極性、滲透能力都不一樣，結果表明丙酮∶乙醇=1∶3的混合溶劑得到最好的提取效果，因此可以選用此溶劑作為提取劑。從提取率隨提取時間的變化可見，提取時間在2～12h時，隨著提取時間的延長，綠藻中的葉綠素提取率快速增加，而從12～24h則未見明顯增加。葉綠素提取是由細胞內向細胞外擴散的過程，因此可以認為經過12h的浸提葉綠素基本能夠從細胞內部擴散到細胞外，即12h可以基本完成葉綠素的提取，所以提取時間可以確定為12h。

表3　不同配方提取劑提取葉綠素的效果Table.3　The chlorophyll extraction effect of different solvents

2.3提取劑用量對葉綠素提取效果的影響

以丙酮∶乙醇＝1∶3的混合溶劑為提取劑，用不同的提取劑用量在30℃下提取12h，測量葉綠素提取效果，結果見圖3。從結果可見，提取劑用量（體積，mL）為藻泥質量（g）的5倍增加到10倍時葉綠素提取率提高明顯，但是提取劑用量增加到10倍以上后葉綠素提取率不再提高，說明10倍的提取劑用量已經足夠。提取劑的用量越高，溶劑回收的負擔越大，生產成本必然提高，因此提取劑用量應適當。

2.4提取溫度對葉綠素提取效果的影響

用丙酮∶乙醇＝1∶3的混合溶劑，提取劑用量（mL）為藻泥重量的10倍，在20～60℃范圍內的不同溫度下提取12h，葉綠素提取效果見圖4。由實驗結果可見，在20℃的溫度下綠藻葉綠素提取率較低，在20～40℃之間，葉綠素提取率逐步提高，40～50℃時提取率達到了最高，為51.54mg/g；50℃之后，葉綠素提取率有下降的趨勢。較高的提取溫度可以加速葉綠素擴散速度，能提高提取效率。但是葉綠素對熱不穩定，在高溫下容易發生分解，提取溫度過高葉綠素得率反而下降。所以，提取溫度的確定既要考慮提取速率又要考慮葉綠素的穩定性，采用40～50℃比較合適。

圖3　提取劑用量對葉綠素提取效果的影響Fig.3　The effects of solvent quantities on the chlorophyll extraction

圖4　提取溫度對葉綠素提取效果的影響Fig.4　The effects of temperatures on the chlorophyll extraction

2.5超聲波處理對葉綠素提取效果的影響

超聲波處理對葉綠素提取效果的影響實驗結果見表4。由結果可見，超聲波處理10、30、45、60min后綠藻葉綠素提取率都比不進行超聲波處理的要低。可見，超聲波輔助提取在本實驗中沒有促進作用的效果。因此，從節約生產成本考慮，以不采用超聲波輔助提取為好。

表4　超聲波處理對葉綠素提取的作用Table.4　The effect of ultrasonication on the chlorophyll extraction

有文獻報道超聲波有利于葉綠素的提取，可以提高提取效率，縮短提取時間[14]，但綠藻中葉綠素提取研究還未見報道。超聲波處理過程中，樣品溫度升高，雖然有利于物質的擴散傳遞，但是葉綠素具有熱不穩定性，容易造成分解。超聲波頻率高，穿透能力強，對于從顆粒大、結構緊密的材料中提取目標物質是有利的，但是富油新綠藻作為單細胞微藻，材料顆粒小，超聲波不能發揮促進提取的作用，相反如使用不當造成提取溫度升高還反會促進葉綠素分解。這可能是本實驗在用超聲波處理時，沒有取得更好提取效果的原因。

2.6正交設計實驗結果

正交設計的實驗結果如表5所示。由極差分析可見，溫度是影響更加明顯的因素，提取劑用量的影響次之，提取時間的影響最小。從各因素對結果的影響趨勢看，提取溫度為45℃時可以獲得最大的提取率，而40℃和50℃的提取溫度下提取率都更低，說明溫度太低提取不盡，溫度太高葉綠素分解也可能增加。提取劑用量從6～8倍提取率增加較大，但是提取劑用量從8～10倍的提取率增加不明顯，提取劑用量的增加會增加溶劑蒸餾的負擔，因此，提取劑用量可以采用藻泥重量的8倍作為提取劑用量。從提取時間的影響看，實驗范圍內對提取效果沒有明顯的影響，提取時間達到8h已經足夠，增加提取時間并不能增加提取效率，這時實驗的其他因素的作用顯得更加重要，所以，看上去10h和12h提取時間獲得的提取率反更少。從提取效果和生產成本綜合來考慮，從富油新綠藻提取葉綠素的工藝條件可以采用A2B2C1即45℃的提取溫度，8倍于藻泥質量的提取劑用量和8h的提取時間。用A2B2C1條件做驗證實驗得到的葉綠素提取率為53.69mg/g。

表5　正交設計實驗結果和統計分析Table.5　The experiment results and analysis of orthogonal design

3　結論

適當增加培養基的氮源含量可以提高富油新綠藻細胞葉綠素含量，在以硝酸鈉為氮源的情況下，氮源濃度為25mmol/L為宜；在葉綠素提取過程中，提取劑用丙酮∶乙醇為1∶3的混合提取劑效果較好，提取劑的體積用量以微藻生物量質量數的8倍為宜，提取溫度45℃可以獲得較高的提取效率又可以避免發生葉綠素的嚴重的熱分解，提取時間8h可以充分完成提取；超聲波輔助不能增加富油新綠藻的葉綠素提取效率，使用不當還可能降低葉綠素得率，因此不必采用超聲波輔助的提取工藝；采用優化的提取工藝條件從富油新綠藻中可以提取葉綠素達到53.69mg/g（對藻干物質）。

[1]Steinmetz K A，Potter J D.Vegetables，fruit and cancer prevention：a review[J].JournaloftheAmericanDietetic Association，1996（10）：1027-1039.

[2]TimberlakeC F，Henry B S.Plant pigments as natural food colours[J].Endeavour，1986，10（1）：31-36.

[3]Li Yanqun，Horsman Mark，Wu Nan，et al.Biofuels from Microalgae[J].Biotechnology Progress，2008，24：815-820.

[4]王冬琴，譚瑜，盧虹玉，等.微藻生物活性物質在食品工業中的應用進展[J].現代食品科技，2013，29（5）：1185-1191.

[5]Rangel-Yagui Carlota de Oliveira，Danesi Eliane Dalva Godoy，Jo?o Carlos Monteiro de Carvalho，et al.Chlorophyll production from Spirulina platensis：cultivation with urea addition by fedbatch process[J].Bioresource Technology，2004，92（2）：133-141.

[6]Schoefs B.Chlorophyll and carotenoid analysis in food products.Properties of the pigments and methods of analysis[J]. Trends in Food Science&Technology，2002，13（11）：361-371.

[7]Schoefs B.Determination of pigments in vegetables[J].Journal of Chromatography A，2004，1054（1-2）：217-226.

[8]SimonD，HelliwellS.Extractionandquantification of chlorophyll a from freshwater green algae[J].Water Research，1998，32（7）：2220-2223.

[9]Fujii K.Process integration of supercritical carbon dioxide extraction and acid treatment for astaxanthin extraction from a vegetative microalga[J].Food and Bioproducts Processing，2012，90（4）：762-766.

[10]Guedes A Catarina，Gi?o S Maria，Matias A Ana，et al. Supercritical fluid extraction of carotenoids and chlorophylls a，b and c，from a wild strain of Scenedesmus obliquus for use in food processing[J].Journal of Food Engineering，2013，116（2）：478-482.

[11]王豐俊，王運強，顧欣，等.響應面法優化超聲波提取構樹葉中葉綠素的工藝研究[J].北京林業大學學報，2010，32（6）：135-140.

[12]Li Yanqun，Wang Bei，Wu Nan，et al.Effects of nitrogen sources on cell growth and lipid production of Neochloris oleoabundans[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2008，81：629-636.

[13]Becker E.Microalgae：biotechnology and microbiology[M]. New York：Cambridge University Press，1994.

[14]王爽，姚秉華.超聲法提取松針葉綠素及穩定性研究[J].紡織高校基礎科學學報，2010，23（1）：87-90.

Study on the extraction of chlorophyll from a green microalga

LI Can-liang，ZHONG Min，HU Xue-qiong，LI Yan-qun*
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，Zhanjiang 524088，China）

In order to study the possibility of the production of natural edible pigment chlorophyll from green microalgae，and to investigate the procession conditions of that production，the effects of nitrogen source contents in the medium on the chlorophyll content of the microalgal cell were investigated，and the effects of the solvent formulas，solvent quantities，extraction time，extraction temperature and ultrasonication on the chlorophyll extraction were studied.The results indicated that a satisfied extract rate could be obtained when 8 times of a complex solvent composed of acetone and ethanol at a ratio of 1∶3 based on the microalgal biomass was utilized and the extraction was performed at 45℃for 8h.At that procession conditions，53.69mg/g（by dry cell weight）of chlorophyll had been extracted from the green microalga Neochloris oleoabundans.

green microalga；Neochloris oleoabundans；chlorophyll

TS201.1

B

1002-0306（2015）04-0199-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.035

2014－02－11

李燦良（1990－），男，本科，研究方向：食品科學與工程。

李雁群（1963－），男，博士，教授，研究方向：食品生物技術。

國家十二五農業領域項目子課題（2011BAD14B03-06）；廣東省國際合作項目（2011B050400027）；廣東海洋大學引進人才啟動項目。