一株產廣譜細菌素乳酸菌菌株的分離鑒定及其細菌素特性研究

劉國榮，宋振芹，任　麗，蘇　航，王成濤

（北京工商大學食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品質量與安全北京實驗室，北京100048）

一株產廣譜細菌素乳酸菌菌株的分離鑒定及其細菌素特性研究

劉國榮，宋振芹，任麗，蘇航，王成濤

（北京工商大學食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品質量與安全北京實驗室，北京100048）

目的：從母乳嬰兒糞便篩選獲得產廣譜細菌素的乳酸菌菌株，并對其所產細菌素的理化及生物學特性進行研究分析，預測其在食品工業中的應用前景。方法：以課題組從母乳嬰兒糞便分離得到的23株乳酸菌為試材，采用牛津杯瓊脂擴散法，選取單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和大腸桿菌（Escherichia coli）為指示菌篩選產廣譜細菌素的優良菌株。通過菌體形態觀察、生理生化特征及16S rDNA序列分析對菌株進行分類學鑒定，并從耐酸、耐熱、蛋白酶敏感性、抑菌譜等角度分析菌株所產細菌素生物學特性。結果：分離得到1株產廣譜細菌素菌株BL-1，發現該菌株所產細菌素具有較好的熱穩定性和酸耐受性，在pH為2、121℃條件下細菌素活性仍然保持穩定，酶敏感性強，胃蛋白酶可將其完全分解，使用安全性較高，且抑菌譜較廣，對受試的李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aereu）等革蘭氏陽性菌和大腸桿菌陰性菌均表現出較強抑菌活性。最后該菌株經分類學鑒定為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）。結論：從母乳嬰兒糞便中分離出一株產廣譜細菌素鼠李糖乳桿菌BL-1，該菌所產細菌素具有優良的食品加工特性，有作為天然食品防腐劑的巨大應用前景。

鼠李糖乳桿菌，細菌素，鑒定，特性

食品加工儲存過程中受有害微生物污染而引起的食品腐敗變質是食品工業急需解決的重要問題，采用化學防腐劑應用于食品防腐保鮮、延長貨架期，影響人體健康，具有一定安全隱患，在食品產業受到越來越多的限制[1-3]，因此研究開發高效、安全、無毒的天然食品防腐劑在食品防腐保鮮中的作用日益突出。

乳酸菌活性代謝產物細菌素是乳酸菌在其生長代謝過程中通過自身核糖體機制合成并分泌到環境中的一類具有抑菌活性的蛋白類物質，在人體內可降解，具有高效、安全、無毒等特點，在天然食品生物防腐劑研究與開發中有著巨大應用潛力，已成為生物防腐劑開發的熱點[4-8]。目前只有乳酸鏈球菌素nisin被批準應用于食品工業，對于其他類具有抑菌活性作用的細菌素的研究鮮有報道，因此，廣泛開發具有應用潛力的天然優質細菌素成為現代食品防腐工業的重要任務之一。

本研究以課題組從母乳嬰兒糞便分離得到的23株乳酸菌為試材，篩選一株產廣譜細菌素優良菌株，并通過形態學觀察、生理生化反應和16S rDNA序列分析對分離得到的菌株進行分類學鑒定，并對該菌株所產細菌素的部分特性，包括其熱敏感性、酸敏感性、蛋白酶敏感性及抑菌譜進行了相關研究，以期獲得生物特性穩定、抑菌譜較廣的乳酸菌菌株，預測其在食品工業中的應用前景，從而為優良乳酸菌的廣泛開發和利用提供參考依據和理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乳酸菌23株乳酸菌分離自母乳嬰兒糞便；單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）54002（1/2a） 美國標準菌種保藏所（ATCC）；單核細胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）35152（4b）衛生部藥品生物制品檢定（NICPBP）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aereu）1.128、金黃色葡萄球菌（S.aereu） 1.169、大腸桿菌（Escherichia coli）普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）；沙門氏菌（Salmonella）C500

中國獸醫微生物菌種保藏中心（CVCC）；伊氏李斯特菌（L.ivanovii）LIV1、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、豬鏈球菌（Streptococcus suis）、假單胞菌（Pseudomonas）、啤酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）、青霉（Penicillium commune） 均由本實驗室保藏；培養基改良MRS固、液厭氧培養基（普通MRS培養基中加入0.3%玉米漿和0.03%L-半胱氨酸鹽酸）LB固、PDA培養基等；碳酸鈣、NaOH、HCl、Na2HPO4、NaH2PO4、無水乙醇、苯酚、氯仿、蛋白酶、中性蛋白酶（芽孢桿菌來源）、蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、溶菌酶、過氧化氫酶等北京藍弋化工產品有限公司。

pHS-25型酸度計上海精密科學儀器有限公司；Supra 22K大容量高速冷凍離心機韓國翰尼（Hanil）公司；Galaxy 170s CO2培養箱艾本德中國有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠。

1.2實驗方法

1.2.1產細菌素菌株的篩選實驗參考牛津杯瓊脂擴散法[8-9]，選取單增李斯特氏菌和大腸桿菌為指示菌篩選產廣譜細菌素的優良菌株。

1.2.2菌株產細菌素的鑒定在篩選鑒定菌株所產為細菌素時，需要排除具有抑菌活性物質乳酸等有機酸、乳酸菌菌體細胞對其他細菌的生物拮抗作用及指示菌生長環境等因素的干擾，以確定為細菌素所引起的抑菌作用[10-12]。具體方法為：pH中和法排除有機酸的干擾；過氧化氫酶處理排除H2O2干擾；細菌濾器去除菌體細胞的干擾。在此基礎上，通過硫酸銨沉淀、透析以及蛋白酶K處理進一步確定抑菌活性物質為蛋白類物質。

1.2.3乳酸菌株分型鑒定

1.2.3.1菌株菌體形態觀察改良MRS培養基厭氧37℃培養，30h后觀察菌落形態；挑取典型菌落革蘭氏染色，光學顯微鏡觀察染色后的菌體形態。

1.2.3.2生理生化檢驗根據生理生化細菌鑒定標準[11-13]，對分離純化后得到的菌株進行生理生化測定，包括20種糖醇發酵、精氨酸產氨、運動性、接觸酶及厭氧生長等。通過參考凌代文編著的《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[4]分析未知菌株在乳酸菌分類學上的地位。

1.2.3.3基于16S rDNA基因序列分析的分子生物學鑒定將篩選得到的菌株提取DNA基因組，通過PCR擴增技術獲取目的基因DNA片段，并將其回收純化，交由北京六合華大基因科技有限公司測序。使用NCBI網站對菌株的16S rDNA序列與所在數據庫中各種菌的16S rDNA序列進行比對分析，并通過blast在GeneBank基因庫中進行同源性搜索[14]。從Genebank中選擇同源性親近的幾株菌株的16S rDNA基因序列，采用Clustalx 1.83軟件進行序列多重比較，用Mega 5.0軟件進行統計和聚類分析，構建系統發育樹，并對所構建的系統發育樹進行評估[15-16]。

1.2.4菌株所產細菌素的生物學特性研究將菌株按1%的接種量接種于改良后的MRS培養基中，37℃下靜置培養24h。取發酵液8000r/min離心，去除菌體細胞，調上清液pH至7.0左右，硫酸銨沉淀法粗提細菌素并透析，以此為細菌素測試樣品備用，進行特性分析。

1.2.4.1pH敏感性分別取1mL細菌素樣品于試管中，調pH為2～11，保持試管最終容積為5mL，37℃溫育4h，調pH回至中性（7.0左右），以未調節pH的加蒸餾水同比稀釋的細菌素樣品（pH=7.0）為對照，測抑菌活性[15-18]，記錄抑菌圈直徑。

1.2.4.2熱敏感性分別取1mL細菌素樣品進行不同溫度（50、60、70、80、90℃和121℃）條件下水浴處理30min，以未經過溫度處理的細菌素樣品為對照，進行抑菌實驗，測抑菌活性。

1.2.4.3蛋白酶的敏感性選取不同蛋白酶（胰酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶。其余待定，實驗時依照情況選擇）將其配成5mg/mL的溶液，分別取0.1mL置于小離心管中，加細菌素樣品0.4mL混合，使酶的終濃度為1mg/mL，并調節pH為各酶的最適pH范圍內，同時以0.1mL緩沖液加入0.4mL細菌素作為對照，37℃溫育4h，調pH回至中性（7.0左右）后抑菌實驗，測抑菌活性[18-21]。

1.2.4.4抑菌譜的測定選取實驗室所保藏指示菌（20株），取1mL稀釋10-3的指示菌，使用牛津杯法，進行抑菌實驗，記錄抑菌圈直徑，測抑菌活性，以期確定該乳酸菌株的抑菌譜。

2　結果與分析

2.1產細菌素乳酸菌的篩選

選取單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）54002（1/2a）和大腸桿菌（Escherichia coli）為指示菌，采用牛津杯擴散法，對課題組分離自母乳嬰兒糞便中的23株乳酸菌進行抑菌實驗，對菌株進行復篩。結果發現測試菌中有13株菌株無抑菌圈或抑菌圈直徑不足10mm，9株菌抑菌圈在10～15mm，篩選獲得菌株BL-1發酵液對單增李斯特氏菌和大腸桿菌抑菌活性都較強，抑菌圈直徑可分別達到22.34mm和23.58mm，故選取BL-1作為進一步實驗的測試菌。

2.2菌株BL-1產細菌素的鑒定

實驗通過排除酸、H2O2酶和菌體細胞等處理以排除對菌株發酵液抑菌的干擾作用，結果如表1所示。將測試菌BL-1發酵液的pH調至6.5～7進行抑菌實驗，結果顯示其抑菌圈直徑與原發酵液相比相差不大；用H2O2酶處理發酵液后發現其抑菌效果基本無差別；用細胞濾器除去菌體細胞后發現發酵液的抑菌作用與未處理效果相差不大。以上實驗均表明測試菌BL-1的抑菌作用與有機酸、H2O2和菌體細胞關系不大。同時，經過80%硫酸銨沉淀并透析，細菌素抑菌活性明顯提高，經蛋白酶K處理后抑菌效果消失，綜上表明：抑菌實驗中，起抑菌作用的物質是其所產細菌素且其本質為蛋白質類物質，進而確定乳酸菌株BL-1為細菌素產生菌。

表1　不同處理對菌株BL-1發酵液抑菌活性的影響Table.1　Effect of different treatments on the inhibitory activityof culture supernatant from strain BL-1

2.3乳酸菌株BL-1的分型鑒定

2.3.1菌株BL-1菌體形態學觀察乳酸菌株BL-1經革蘭氏染色為陽性，利用光學顯微鏡觀察其菌落形態特征為菌體呈明顯的桿狀，無芽孢，不運動，菌落圓形，邊緣較光滑平整，接觸酶陰性，兼性厭氧，15℃生長，除明顯的分叉形態外，少數呈棒狀，排列無明顯規則。具有典型的乳酸桿菌形態特征。

2.3.2生理生化實驗表2為菌株BL-1的生理生化鑒定結果。通過結果可以看出菌株BL-1可發酵纖維二糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蜜二糖、棉籽糖、核糖、山梨醇、山梨糖、蔗糖、海藻糖、鼠李糖等多種糖類，精氨酸不產氨，厭氧生長。根據鑒定結果查表，并結合革蘭氏染色觀察結果，可初步確定BL-1菌株屬于乳酸桿菌。

表2　菌株BL-1的生理生化鑒定結果Table.2　Physiological and biochemical characteristics of strain BL-1

圖1　基于16S rDNA序列的BL-1系統發育樹Fig.1　Phylogenetic tree of strain BL-1 based on the 16S rDNA sequence

2.3.316S rDNA基因序列分析及系統發育樹構建測試菌株BL-1經擴增測序后得到1476bp DNA堿基序列。將測序結果在NCBI上的Genebank中進行同源性比對，在GeneBank基因庫中進行同源性搜索。從Genebank中選擇同源性親近的前幾株菌株的16S rDNA基因序列，應用Mega 5.0軟件進行統計和聚類分析，構建系統發育樹，發育樹結果見圖1。軟件進行多重比較后，菌株BL-1與同源性搜索后關系最近的前21株來自鼠李糖乳桿菌的親緣性最高，與菌株Lactobacillus rhamnosus（其登錄號分別為：AP011548.1）處于同一個小分支，親緣關系最接近，同源相似度高達99.9%，結合形態學觀察和生理生化實驗鑒定結果，可進一步確定菌株BL-1為鼠李糖乳桿菌。

2.4菌株BL-1所產細菌素的生物學特性研究

2.4.1pH敏感性實驗結果如表3所示，乳酸菌株BL-1所產細菌素的抑菌活性pH范圍為2～10，其中在pH5～8內，活性較高，而pH小于5、大于8時，抑菌活性有降低趨勢，在pH為11時，細菌素失活，原因可能是由于大部分細菌素在弱酸性和中性條件下比較穩定，過堿性條件下即會失活。在pH為2時，乳酸菌株BL-1所產細菌素仍保持穩定活性，具有明顯的抑菌效果。實驗結果表明此菌株所產細菌素具有很好的耐酸性，且具有較寬泛的pH活性范圍，可在酸性和中性食品中使用，為乳酸菌發酵產物在不同食品加工中的應用環境提供了一定的理論參考依據。

表3　菌株BL-1所產抑菌物質的pH敏感性Table.3　pH stability of bacteriocin produced by strain BL-1

2.4.2熱敏感性實驗結果如表4所表明，BL-1菌株發酵液經過60～121℃、30min熱處理后，抑菌活性基本沒有明顯的變化，且在121℃作用條件下，仍保持一定的抑菌活性，由此可以得出該菌株發酵液具有較好熱穩定性，在食品加工常用的巴氏滅菌范圍（65～80℃，15min）內仍保持較好的抑菌活性，預示其在食品加工工業具有更廣闊的應用前景。

表4　菌株BL-1所產抑菌物質的熱敏感性Table.4　Heat stability of bacteriocin produced by strain BL-1

2.4.3蛋白酶敏感性實驗結果如表5所示，BL-1菌株所產細菌素對胃蛋白酶及胰蛋白酶十分敏感，可被胃蛋白酶和胰蛋白酶完全失活；對酸性蛋白酶、中性蛋白酶和溶菌酶無強烈敏感性，僅表現出部分失活。出現這種現象的原因可能與乳酸菌特殊的生理活性有關，而胃蛋白酶、胰蛋白酶是人體腸道內正常存在的酶類，所以此類細菌素可在人體內被消化、無殘留，預示了其可進入體內發揮生物學作用的安全性，對乳酸菌在食品工業的實際應用提供了一定的理論參考價值。

表5　菌株BL-1所產抑菌物質的蛋白敏感性Table.5　Effect of various protease on bacteriocin produced by strain BL-1

表6　菌株BL-1抑菌產物的抑菌譜Table.6　Antimicrobial spectrum of bacteriocin produced by strain BL-1

2.4.4抑菌譜的測定抑菌譜測定結果如表6所示，該乳酸菌株BL-1所產細菌素抑菌譜較廣，對受試20株指示菌中的7株李斯特菌、3株金黃色葡萄球菌、凝結芽孢桿菌、豬鏈球菌等革蘭氏陽性菌和對指示菌中大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌有很明顯的抑制作用，抑菌譜較廣，且表現出不同的抑菌活性，對啤酒酵母、青霉等真菌則無明顯的抑制效果。由此可得該乳酸菌株所產細菌素可抑制食品中多種常見的腐敗菌、致病菌，在食品工業中天然防腐劑的加工應用中具有廣泛的應用潛力，可廣泛應用于食品的防腐殺菌處理。

3　討論

鼠李糖乳桿菌是健康人體腸道中的正常菌群，有增強宿主腸道抵抗力、加強免疫系統的功效，同時也是食品中正常菌群的組成部分，廣泛存在于肉制品和發酵食品中。國內有研究表明鼠李糖乳桿菌可發酵產生細菌素，其細菌素具有很好的抑菌效果，能抑制食品中多種常見腐敗菌、致病菌的生長，有望作為新型天然生物防腐劑應用于食品的防腐保鮮。國外對鼠李糖乳桿菌的研究相對較多，但多集中在其功能特性的研究，對鼠李糖乳桿菌及其所產細菌素生物特性研究較少，國內更是鮮有報道。國外已經發現且報道最多的能產生細菌素的鼠李糖乳桿菌為Lactobacillus rhamnosus GG（ATCC 53103），分離來自于健康人體腸道，具有耐受動物消化道環境、提高機體免疫力等功能特性。本實驗中研究的鼠李糖乳桿菌BL-1是國內首次報道的產廣譜細菌素產生菌，已報道的LGG所產細菌素抑菌譜較窄，對單核細胞增生李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌和多數乳酸菌有抑制作用，但對常見致病菌如金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌沒有抑制作用，在食品的防腐保鮮加工應用中有一定限制，與LGG所產細菌素相比，BL-1所產細菌素具有較廣的抑菌譜，除了可以強烈抑制革蘭氏陽性菌李斯特菌和金黃色葡萄球菌等致病菌的生長外，對大腸桿菌等革蘭氏陰性細菌也表現一定抑菌活性，且抑菌效果較好，顯示出其在食品防腐保鮮加工工業中更廣闊的應用前景。

4　結論

以課題組從母乳嬰兒糞便分離得到的23株乳酸菌為試材，通過多次篩選獲得一株產廣譜細菌素的優良菌株BL-1，并確定了其所產細菌素為蛋白類物質，同時，通過形態學觀察、生理生化反應和16S rDNA序列分析的方法進行分類學鑒定，確定該產廣譜細菌素菌株BL-1為鼠李糖乳桿菌。

通過細菌素生物學特性研究顯示：乳酸菌株BL-1所產細菌素具有良好的熱穩定性，在121℃高溫30min處理條件下仍然保持較高的抑菌活性；具有較好的酸堿耐受性，抑菌活性pH范圍為2～10，耐酸，在pH為2時仍保持穩定的抑菌活性；且具有與人體腸道特征相符合的酶敏感性，胃蛋白酶可將其完全分解，使用安全性較高；此外，抑菌實驗表明菌株BL-1所產細菌素具有較廣的抑菌譜，對生活中常見的多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性致病菌、腐敗菌均有較好的抑菌效果。上述結論表明鼠李糖乳桿菌BL-1所產細菌素具有良好的食品加工特性，在食品工業天然防腐劑的開發利用中有著巨大的應用空間和潛力。

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Study on separation and identification of a broad spectrum of bacteria producing lactic acid bacteria strains and characterization of its bacteriocin

LIU Guo-rong，SONG Zhen-qin，REN Li，SU Hang，WANG Cheng-tao
（Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

Objective：To obtain a broad spectrum of bacteriocin-producing lactic acid bacteria strains from breastfeeding baby stool，researching and analyzing its physicochemical and biological properties of bacteriocins，predict its potential applications in the food industry.Methods：The antimicrobial activity of 23 Lactobacillus strains isolated from breastfeeding infant faeces was tested by the oxford cup agar diffusion method using Listeria monocytogenes and E.coli as indicator bacteria.The strains were identified by cell morphological，physiological，biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis，and from the acid，heat，protease sensitivity，antibacterial spectrum angles，analyze the biological characteristics of bacteriocins. Results：A broad spectrum bacteriocin producing strains BL-1 was isolated in this study.And results showed its bacteriocins have strong thermal stability and acid tolerance.Under the conditions of pH of 2，121℃，the bacteriocin activity remained stable and the pepsin could be completely decomposed it.And this bacteriocin showed the higher security and broad spectrum antimicrobial，the inhibitory effect was very obvious against Listeria monocytogenes，Staphylococcus aureus and other Gram-positive and negative bacteria such as Escherichia coli.Finally，it was identified as Lactobacillus rhamnosus.Conclusion：In this study，we isolated a broad spectrum bacteriocin producing Lactobacillus rhamnosus BL-1，and we found that its bacteriocin had excellent biological characteristics and great application prospects on the development of natural biological preservatives.

Lactobacillus rhamnosus；bacteriocin；identification；characteristics

TS201.3

A

1002-0306（2015）04-0180-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.031

2014－04－21

劉國榮（1983－），女，博士，副教授，研究方向：食品微生物學。

北京市自然科學基金預探索項目（5133034）；國家自然科學基金青年基金項目（31201407）；國家十二五科技支撐項目（2013BAD18B12-05）。