細(xì)菌纖維素產(chǎn)生菌選育與突變株發(fā)酵特性的研究

鄧毛程，李　靜，王　瑤，陳維新，吳永輝（.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州50300；.廣州倚德生物科技有限公司，廣東廣州5340）

細(xì)菌纖維素產(chǎn)生菌選育與突變株發(fā)酵特性的研究

鄧毛程1，李靜1，王瑤1，陳維新1，吳永輝2
（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州510300；2.廣州倚德生物科技有限公司，廣東廣州511340）

為了獲得細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株，采用紫外線和硫酸二乙酯對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的木葡糖酸醋桿菌BC13進(jìn)行復(fù)合誘變。通過(guò)誘變、篩選和連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)，獲得1株產(chǎn)量達(dá)15.6g/L的高產(chǎn)突變株Y19-11，該菌株遺傳穩(wěn)定性良好，比原出發(fā)菌株產(chǎn)量提高44.4%。同時(shí)，通過(guò)比較不同溫度、不同初始pH下的菌體量和細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，確定突變株Y19-11的最適溫度和初始pH分別為30℃和5.5。

細(xì)菌纖維素，紫外線誘變，硫酸二乙酯誘變，發(fā)酵特性

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，簡(jiǎn)稱BC）最早由英國(guó)科學(xué)家Brown發(fā)現(xiàn)[1]，是由微生物（主要是細(xì)菌）利用液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)胞外纖維素，與植物纖維素一樣，都是由葡萄糖基通過(guò)β-1，4-糖苷鍵連接起來(lái)的大分子[2]。與植物纖維素相比，細(xì)菌纖維素具有高結(jié)晶度、高化學(xué)純度、高抗張強(qiáng)度、高彈性模量、吸水性強(qiáng)和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)使其在食品、生物醫(yī)藥、組織工程支架材料、聲學(xué)器材、化妝品、膜過(guò)濾材料、造紙等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[3-5]。

迄今為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)醋酸菌屬（Acetobacter）、假 單 胞 菌 屬（Prudomonas）、無(wú) 色 桿 菌 屬（Achromobacter）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligcncs）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、固氮菌屬（Azotobacter）、氣桿菌屬（Aerobacter）、根瘤菌屬（Rhizobium）和八疊球菌屬（Sarcina）等九個(gè)屬中某些微生物能夠合成細(xì)菌纖維素，其中，木醋桿菌（Acetobacter xylinum）是目前最常用和產(chǎn)率最高的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌[3，6]。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員一直致力于細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌的選育工作[5，7-8]，但現(xiàn)有菌種的細(xì)菌纖維素產(chǎn)率依然較低。為了進(jìn)一步提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)生菌的產(chǎn)率，本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室已獲得的野生菌株進(jìn)行復(fù)合誘變選育，以期獲得高產(chǎn)的突變株，為細(xì)菌纖維素的研究和生產(chǎn)提供優(yōu)良菌種。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

木葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）BC13廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系篩選與保藏的菌種；固體培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，瓊脂20g/L，pH5.5，121℃滅菌20min；液體培養(yǎng)基葡萄糖50g/L，酵母膏10g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L；新鮮椰子水椰子破殼取水，50%（v/v），pH5.5，121℃滅菌20min。

SHZ-82A恒溫水浴振蕩器江蘇省太倉(cāng)醫(yī)療器械廠；KDC-210HR高速冷凍離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；A200基因擴(kuò)增儀杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；RDY-SP1Z核酸電泳儀北京榮陽(yáng)經(jīng)典科技有限公司；GI-1凝膠成像系統(tǒng)通寶達(dá)成科技（北京）有限公司；S-3000N掃描電鏡日本日立公司，VERTEX70傅立葉紅外光譜儀德國(guó)布魯克公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌懸液的制備用適量的無(wú)菌生理鹽水將斜面上的菌種洗下，置于渦旋振蕩器上振蕩5min，再用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌體濃度，使?jié)舛葹?06～107個(gè)/mL。

1.2.2出發(fā)株的紫外誘變將出發(fā)株BC13的菌懸液放入無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，置于紫外燈（30W，254nm）下方20cm處進(jìn)行照射處理，照射期間采用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，每隔10s取樣進(jìn)行適當(dāng)稀釋，涂布平板培養(yǎng)基，于30℃下避光培養(yǎng)72h，觀測(cè)菌落數(shù)，以未經(jīng)照射的平板為參照，計(jì)算紫外誘變的致死率，選擇適宜的誘變劑量。然后，在優(yōu)選劑量下對(duì)菌懸液進(jìn)行處理，經(jīng)平板分離、液體發(fā)酵篩選，篩選出高產(chǎn)的UV突變株。

1.2.3UV突變株的化學(xué)誘變采用硫酸二乙酯進(jìn)行化學(xué)誘變，操作參照文獻(xiàn)[9]的方法。在UV突變株的菌懸液中，加入硫酸二乙酯，使其濃度為1%（v/v），于30℃下振蕩處理，每隔5min取出1mL的菌懸液，用0.5mL硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，再進(jìn)行適當(dāng)稀釋，涂布平板培養(yǎng)基，于30℃下避光培養(yǎng)72h，觀測(cè)菌落數(shù)，以未經(jīng)處理的平板為參照，選擇適宜的誘變劑量。然后，在優(yōu)選劑量下對(duì)菌懸液進(jìn)行處理，經(jīng)平板分離、液體發(fā)酵篩選，篩選出高產(chǎn)的硫酸二乙酯突變株。

1.2.4突變株的分離與篩選將優(yōu)選劑量下處理的菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，涂布平板培養(yǎng)基，于30℃下避光培養(yǎng)72h，挑取顆粒圓潤(rùn)，外形完整飽滿的菌落，接入斜面培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24h，然后將斜面菌種接入裝有100mL液體培養(yǎng)基的三角瓶，置于30℃、150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)12h，再靜止發(fā)酵10d，測(cè)定細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，篩選出高產(chǎn)的突變株。

1.2.5傳代穩(wěn)定性的分析將上述優(yōu)選突變株的斜面菌種轉(zhuǎn)接斜面10次，每次的斜面培養(yǎng)24h，然后將各次的斜面菌種接入裝有100mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，按1.2.4中的方法進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液中細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，分析突變株的傳代穩(wěn)定性。

1.2.6突變株發(fā)酵溫度的分析將上述選突變株的斜面菌種接入裝有100mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，分別在不同溫度下，振蕩（150r/min）培養(yǎng)12h，再靜止發(fā)酵72h，測(cè)定發(fā)酵液中的菌體量。同時(shí)，以相同條件和方式進(jìn)行發(fā)酵，靜止發(fā)酵10d后，測(cè)定發(fā)酵液中的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，分析突變株的適宜發(fā)酵溫度。

1.2.7突變株發(fā)酵pH的分析將液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至不同pH，按1.2.6中方法，在30℃下進(jìn)行發(fā)酵，分別測(cè)定發(fā)酵液中的菌體量和細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，分析適宜的初始發(fā)酵pH。

1.2.8指標(biāo)的測(cè)定

1.2.8.1細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（干重）的測(cè)定采用稱重法測(cè)定發(fā)酵液中細(xì)菌纖維素產(chǎn)量[10]。將發(fā)酵液中的凝膠膜狀產(chǎn)物取出，用純凈水漂洗干凈，放入0.1mol/L的NaOH溶液中煮沸30min，用蒸餾水漂洗至中性，于105℃的條件下干燥，直至恒重，然后準(zhǔn)確稱量干燥物的質(zhì)量，即可計(jì)算細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（干重）。計(jì)算公式如下：

1.2.8.2菌體量（干重）的測(cè)定改進(jìn)文獻(xiàn)[11]提供的方法，將發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)至5.0，加入3g纖維素酶粉（10000U/g），置于40℃下振蕩酶解2h，然后離心分離（12000r/min，15min），收集沉淀物，于80℃下干燥，恒重后稱量干燥物質(zhì)量，菌體量的計(jì)算公式如下：

菌體干重（g）=離心沉淀物干燥質(zhì)量（g）-3

1.2.8.3紫外誘變的致死率的計(jì)算致死率的計(jì)算如下式：

致死率（%）=[（參照平板上的菌落數(shù)-誘變平板上的菌落數(shù)）/參照平板上的菌落數(shù)]×100

2　結(jié)果與討論

2.1紫外線誘變與篩選

紫外線對(duì)菌種BC13的致死率曲線如圖1所示。隨著紫外線照射時(shí)間的增大，菌種BC13的致死率呈上升的趨勢(shì)，照射時(shí)間超過(guò)60s以后的致死率十分接近100%。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12]，致死率較高時(shí)，存活的菌株出現(xiàn)正突變概率較小，但正突變菌株的產(chǎn)量提高幅度有可能很大，因而較多研究者選擇致死率在80%～90%之間的劑量為最佳誘變劑量[13-15]。從圖1可看出，紫外線照射30s時(shí)的致死率為88.2%，故被選為最佳誘變劑量。

圖1　紫外線誘變的致死率曲線Fig.1　Motality curve of UV mutagenesis

菌種BC13在此劑量下進(jìn)行誘變，經(jīng)平板分離，挑取96株菌株，再經(jīng)發(fā)酵篩選，獲得產(chǎn)量提高幅度達(dá)10%以上的菌株有8株，它們和出發(fā)菌株BC13的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量如圖2所示。由圖2可知，這8株菌的產(chǎn)量在11.9～12.7g/L之間，產(chǎn)量增加幅度的范圍為10.2%～17.6%，其中突變株Y26的產(chǎn)量最高，達(dá)12.7g/L，優(yōu)于近年來(lái)湯衛(wèi)華[9]、萬(wàn)中義、Mohite等[16-17]的研究成果。

圖2　紫外線突變株的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量Fig.2　Bacterial cellulose（BC）yield data of strains treated by UV mutation

2.2硫酸二乙酯誘變與篩選

利用硫酸二乙酯對(duì)8株紫外線突變株進(jìn)行處理，致死率的數(shù)據(jù)分布如表1所示。8株菌的致死率隨硫酸二乙酯作用時(shí)間延長(zhǎng)而增大，在30min時(shí)的致死率都在80%～90%之間，在40min及以后的致死率均超過(guò)90%，故優(yōu)選30min作為硫酸二乙酯對(duì)這8株菌的最佳誘變劑量。

表1　硫酸二乙酯誘變的致死率（%）Table.1　Motality of diethyl sulfate mutagenesis（%）

在最佳誘變劑量下，利用硫酸二乙酯分別對(duì)紫外線照射的突變株Y02、Y14、Y19、Y26、Y32、Y37、Y45和Y48進(jìn)行化學(xué)誘變，經(jīng)平板分離、發(fā)酵篩選，選出產(chǎn)量比出發(fā)菌株BC13增加30%的菌株15株，它們的產(chǎn)量在14.1～15.6g/L之間，產(chǎn)量增加幅度的范圍為30.6%～44.4%，如表2所示。經(jīng)硫酸二乙酯誘變處理，有一部分產(chǎn)量較高的紫外線突變株發(fā)生了負(fù)突變，從突變株Y32和Y48的處理液中沒(méi)有獲得正突變幅度較大的菌株，產(chǎn)量最大的突變株Y26的正突變概率也相對(duì)減小；在此次誘變處理中，由突變株Y19誘變得到的菌株Y19-11的產(chǎn)量最大，達(dá)到15.6g/L，比突變株Y19的產(chǎn)量增加27.9%，比出發(fā)菌株BC13的產(chǎn)量增加44.4%。本結(jié)果較湯衛(wèi)華[9]文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量9.91g/L有較大幅度提高，因此，將突變株Y19-11優(yōu)選為進(jìn)一步研究的對(duì)象。

表2　硫酸二乙酯突變株的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量Table.2　Bacterial cellulose（BC）yield data of strains treated by diethyl sulfate mutagenesis

2.3傳代穩(wěn)定性分析

將突變株Y19-11的斜面菌種進(jìn)行轉(zhuǎn)接斜面10次，各次斜面菌種的液體發(fā)酵結(jié)果如圖3所示。從圖3看出，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量在14.9～15.8g/L的范圍內(nèi)波動(dòng)，波動(dòng)幅度很小，其中8次的產(chǎn)量均在15.4g/L以上，表明突變株Y19-11具有良好的傳代穩(wěn)定性，其高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的性能可以比較穩(wěn)定地保持，較出發(fā)菌株產(chǎn)量增加37.9%～46.2%。

圖3　傳代10次的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量Fig.3　Bacterial cellulose（BC）yield data of strain during 10 times passaged

圖4　不同溫度下的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量和菌體重量Fig.4　Bacterial cellulose（BC）yield and cell weight under different temperature

2.4突變株的適宜溫度

將突變株Y19-11分別在不同溫度下進(jìn)行液體發(fā)酵，靜止發(fā)酵3d的菌體量和靜止發(fā)酵10d的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量如圖4所示。可以看出，菌體量和細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的關(guān)系大致為正相關(guān)，這與先前文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論基本一致[18-20]。菌體量和細(xì)菌纖維素產(chǎn)量在28～32℃之間處于較大，其中30℃的菌體量和細(xì)菌纖維素產(chǎn)量均為最大，分別為1.62g/L和15.6g/L。實(shí)驗(yàn)表明，突變株Y19-11的最適發(fā)酵溫度為30℃。

2.5突變株的適宜初始pH

在不同的初始pH下，突變株Y19-11靜止發(fā)酵3d的菌體量和靜止發(fā)酵10d的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量如圖5所示。在初始pH為5.0～6.0的范圍內(nèi)，菌體量和細(xì)菌纖維素產(chǎn)量較大，兩者在初始pH為5.5時(shí)均達(dá)到最大。在細(xì)菌纖維素產(chǎn)生的同時(shí)，會(huì)伴隨產(chǎn)生酸類代謝產(chǎn)物，發(fā)酵液的pH下降幅度較大，不利于菌種生長(zhǎng)和發(fā)酵，但淺層靜態(tài)發(fā)酵（目前細(xì)菌纖維素發(fā)酵的主要工藝）過(guò)程難以調(diào)解pH，因而初始pH的控制十分重要。從圖5看出，突變株Y19-11的最適初始pH宜選擇為5.5。

圖5　不同初始pH下的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量和菌體量Fig.5　Bacterial cellulose（BC）yield and cell weight under different initial pH value

3　結(jié)論

目前，國(guó)內(nèi)外研究人員的研究熱點(diǎn)主要還集中在低值碳源、能源的篩選[21-23]，包括各種食品加工廢渣、釀造廢水等，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量基本在10g/L以下，對(duì)優(yōu)良菌種開(kāi)展誘變育種的研究較少，本文以木糖酸醋桿菌BC13為出發(fā)菌株，利用紫外線對(duì)其進(jìn)行誘變，篩選獲得細(xì)菌纖維素產(chǎn)量增加幅度為10%的突變株8株。然后，利用硫酸二乙酯對(duì)8株紫外線突變株進(jìn)行復(fù)合誘變，篩選獲得產(chǎn)量比菌株BC13增加30%以上的突變株15株。其中，突變株Y19-11的產(chǎn)量最大，其產(chǎn)量達(dá)15.6g/L，比菌株BC13的產(chǎn)量增加44.4%。經(jīng)過(guò)10次轉(zhuǎn)接斜面和發(fā)酵，突變株Y19-11的發(fā)酵產(chǎn)量波動(dòng)極小，表現(xiàn)了良好的遺傳穩(wěn)定性。分別在不同溫度、不同初始pH下進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)比較菌體量和細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，確定突變株Y19-11的最適溫度和初始pH分別為30℃和5.5。該菌株具有生產(chǎn)應(yīng)用的潛力，但仍需對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行深入的研究。

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Study on breeding of bacterial cellulose producing strain and fermentation characteristics of mutation strain

DENG Mao-cheng1，LI Jing1，WANG Yao1，CHEN Wei-xin1，WU Yong-hui2
（1.Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，China；2.Guangzhou Yide Biotechnology Co.，Ltd.，Guangzhou 511340，China）

In order to obtain high bacterial cellulose（BC）-producing strain，composite mutagenesis of ultraviolet and diethyl sulfate was used to Gluconacetobacter xylinus BC13 which preserved in laboratory.A high-yield mutant strain Y19-11，BC yield reached 15.6g/L，was obtained by mutagenesis，screening and continuous passage.The mutant strain had excellent genetic stability and its BC yield increased by 44.4%，higher than the original strain.Meanwhile，through comparing the cell weight and yield of BC under different temperature and initial pH value，the optimal temperature and initial pH of mutant strain Y19-11 were determined as 30℃and 5.5，respectively.

bacterial cellulose；ultraviolet mutagenesis；diethyl sulfate mutagenesis；fermentation characteristics

TS201.2

A

1002-0306（2015）04-0159-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.026

2014－04－24

鄧毛程（1971－），男，博士，教授，研究方向：生物工程。

2010年廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010Y1-C571）；2010年廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010B011000008）；2011年廣東省教育廳省級(jí)工程中心建設(shè)項(xiàng)目（GCZX-B1103）。