大葉苦丁茶抗氧化成分的提取及活性的比較研究

金亞香，孫　晶，李洪軍

（吉林大學中日聯誼醫院，吉林長春130033）

大葉苦丁茶抗氧化成分的提取及活性的比較研究

金亞香，孫晶，李洪軍*

（吉林大學中日聯誼醫院，吉林長春130033）

大葉苦丁茶是一種傳統的食藥兩用茶飲品，含有多種活性成分，為了提高大葉苦丁茶的利用效率，采用85%乙醇提取，并依次分別用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇進行液-液萃取，分別得到石油醚組分（PS）、乙酸乙酯組分（PA）、氯仿組分（PC）、正丁醇組分（PB），和剩余的水溶性部分（PW）。隨后采用化學方法對各組分進行定性和定量鑒定，并研究了各組分體外對DPPH自由基的清除作用，和體內對脂質過氧化小鼠血清中SOD和MDA的影響。結果表明，乙酸乙酯萃取組分主要為酚類和黃酮類，氯仿萃取組分中主要為蛋白質和生物堿類，正丁醇萃取組分主要為蛋白質類物質，而水相主要含有蛋白質和糖類。PA對DPPH自由基清除作用最好，當其濃度為100mg/mL時，最高清除率可達到50%。其次是PW、PC和PB。此外體內抗氧化實驗表明PA和PW能夠顯著提高小鼠血清中SOD活性，降低MDA產量，與陽性對照組治療效果接近，與模型組有顯著差異。

大葉苦丁茶，抗氧化活性，分級萃取

大葉苦丁茶（Ilex Kudingcha C.J.Tsing），又名富丁茶，原植物來源為大葉冬青及苦丁茶冬青，為冬青科常綠喬木。因其生長于山巒溪澗之間，且沖泡后具有先苦后甘的口感而得名[1]。它既可以作為飲品，又具有神奇的藥用價值。早在明代李時珍所著《本草綱目》中便有記載其主治：煮飲，止渴、明目、除煩，令人不唾，消痰利水[2]。大葉苦丁茶中的主要化學成分包括黃酮類、多酚類、三萜類、有機酸、氨基酸類和多種微量元素、維生素類[3-4]等。這些活性成分單獨、或是聯合發揮多種藥理活性，包括清涼解毒、降脂、降壓、抑菌、抗氧化、減肥等功效[5-6]。研究表明，從大葉冬青苦丁茶中分離的多酚、多糖、生物堿、黃酮類生物分子都具有明顯的抗氧化性能，尤其是黃酮類和多酚類可以在食物油中溶解，所以可以被用作油脂、食品等的抗氧化劑[7]。食用后，也可以延緩衰老，清除體內的自由基。然而大葉苦丁茶中的主要活性成分極性等差異較大，所以采用單一溶劑提取效率不高，利用有機溶劑分級萃取植物中不同極性組分的方法已被應用于玉竹降糖組分的提取中，這種方法簡單、快速，能夠提高植物的利用率[8]。所以本文亦采用有機溶劑對大葉苦丁茶粗提物進行分級萃取，并分別對各種提取物體內和體外的抗氧化活性進行了評價，對大葉苦丁茶的綜合開發利用有一定意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大葉苦丁茶原料產自浙江紹興的大葉冬青苦丁茶；實驗動物昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，合格證號為SCXK-（吉）2010-0003，由長春生物制品研究所提供；DPPH、碘化鉍鉀試劑、雙縮脲試劑、茚三酮試劑、香草醛-硫酸試劑等購自北京化工廠；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測定試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。

DHP-908型電熱恒溫培養箱上海一恒儀器有限公司；UV-3150型紫外可見近紅外分光光度計日本島津公司。

1.2實驗方法

1.2.1大葉苦丁茶主要成分的提取準確稱取100g干燥的大葉苦丁茶，用小型機械粉碎機粉碎、研缽研磨后過60目篩，提取工藝為：85%乙醇∶茶（v/w）為10∶1，回流提取2次，合并濾液，減壓濃縮，蒸干得粗提物。然后該提取物用100mL蒸餾水重懸，并依次分別用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇進行液-液萃取，回收溶劑，分別得到石油醚組分（PS）、乙酸乙酯組分（PA）、氯仿組分（PC）、正丁醇組分（PB）和剩余的水溶性部分（PW），將各組分中溶劑充分揮發或蒸干，重復三次[8]。樣品冷凍干燥，備用。

1.2.2大葉苦丁茶成分分析依照王曦[9]方法定性分析各種提取物中化學成分的種類，初步確定其中可能的活性物質。檢測是否存在氨基酸、多肽、蛋白質、還原糖、糖類、鞣酸、酚類、生物堿類、甾醇類、環烯醚萜類、有機酸、油、揮發油、蒽醌類、黃酮類、香豆素和內酯類化合物。隨后根據定性分析結果按照孫文基[10]，采用比色法對可能存在的物質分別進行定量測定。

1.2.3提取物對DPPH自由基的清除作用1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）是一種穩定的自由基。將DPPH以50%乙醇配制成25μmol/L的溶液，反應體系為2.0mL一定濃度提取物和2.0mL DPPH，空白組以2.0mL 50%乙醇代替DPPH，對照為2.0mL 50%乙醇和2.0mL DPPH，各組反應液在室溫下靜置30min后測定517nm處的吸光度值。實驗結果以清除率表示，計算公式如下[11]：

清除率I（%）=[1-（A樣品-A空白）/A對照]×100

式中：A樣品為樣品溶液吸光度值，A空白和A對照分別為空白組和對照組吸光度值。采用PS、PA、PC、PB、PW分別代表石油醚組、乙酸乙酯組、氯仿組、正丁醇組和剩余的水提物組；黃酮苷和蟲草多糖為陽性對照組。

1.2.4大葉苦丁茶提取物體內抗氧化活性的研究將70只小鼠隨機分成7組，每組10只，雌雄各半。分為空白組、模型組、陽性對照組、PA組、PC組、PB組、PW組。除空白組每天皮下注射生理鹽水外，其余各組小鼠每天皮下注射D-半乳糖，給藥劑量為125mg/kg，連續45d。建模同時灌胃給藥。空白組和模型組每日口服生理鹽水，陽性對照組小鼠給予100mg/（kg·d）維生素E，實驗組小鼠分別給予400mg/（kg·d）的PA、PC、PB或PW提取物。末次給藥后，眼眶靜脈叢取血，3500r/min離心10min，取血清，-20℃保存，并采用試劑盒測定血清中SOD和MDA活力[12]。

2　結果與分析

2.1大葉苦丁茶提取物制備

100g干燥的大葉苦丁茶用85%的乙醇提取后，得到（12.4±1.8）g粗提物，用100mL蒸餾水重懸，隨后根據大葉苦丁茶中組分的極性差異，分別采用石油醚、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇對粗提物進行萃取，以單位質量苦丁茶原料中得到的提取物質量計算提取率，結果如表1所示。其中石油醚萃取物提取率最低，乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物提取率最高，說明粗提物中非極性物質較少，而極性大的物質更容易被85%乙醇溶液提取出來，相對于傳統的氯仿等單一溶劑提取，對大葉苦丁茶的利用率更高。

表1　大葉苦丁茶有效成分提取結果Table.1　Extraction result of the main components extracted from Ilex Kudingcha C.J.Tsing

表2　粗提物化學成分初步分析結果Table.2　Preliminary chemical analysis results of crude extracts

2.2大葉苦丁茶提取物中成分鑒別

由于每種化學物質均可以通過顏色反應進行鑒別，采用了多種方法鑒別未知組分的種類，實驗結果如表2所示。從表2中可以看出，石油醚萃取組分中不含有檢測的幾種物質，可能是由于石油醚非極性強，主要能溶解的是脂質類物質。此外，乙酸乙酯萃取組分主要為酚類和黃酮類，氯仿萃取組分中主要為蛋白質和生物堿類，正丁醇萃取組分主要為蛋白質類物質，而水相主要含有蛋白質和糖類。通過比色法測定PA、PC、PB和PW中各種物質的含量，結果顯示PA中總多酚含量為0.5%，總黃酮含量為0.6%。PC中蛋白質含量為3.5%，總生物堿含量為0.6%，PB中蛋白質含量為12.4%，PW中蛋白質含量為4.8%，多糖含量為1.2%。

2.3大葉苦丁茶各組分的抗氧化活性比較

2.3.1對DPPH自由基的清除作用大葉苦丁茶分級提取物對DPPH自由基的清除作用如圖1所示。五種提取物中，PS無抗氧化能力，而PA、PC、PB、PW都具有一定的清除DPPH自由基作用，且都具有劑量依賴性，隨著給藥濃度的逐漸增加，其對DPPH自由基的清除能力也逐漸增強。PA對DPPH自由基清除作用最好，當其濃度為100mg/mL時，最高清除率可達到50%。其次是PW、PC和PB。PB中含有較多含量的蛋白質，在經過氯仿和正丁醇萃取后多變性，較難維持抗氧化活性。與黃酮苷、蟲草多糖對照品的抗氧化活性比較可以看出，PA和黃酮苷對DPPH自由基的清除作用接近，而PW和蟲草多糖具有相似的抗氧化結果，可以推測，大葉苦丁茶中具有抗氧化作用的物質可能是黃酮和多糖類，但是PA萃取物中的多酚成分是否也同樣具有抗氧化活性，有待進一步研究。

2.3.2大葉苦丁茶提取物體內抗氧化活性的研究SOD是機體內天然存在的超氧自由基清除因子，它可以把有害的超氧自由基轉化為過氧化氫。而（MDA）是膜脂過氧化最重要的產物之一。脂質過氧化能夠破壞體內多種蛋白質，其增強被認為是機體發生多種疾病的誘因[13]。D-半乳糖能導致小鼠發生脂質過氧化，經過維生素E、PA、PC、PB、PW治療后，各實驗組小鼠血清中SOD和MDA活性如圖2所示。從圖2中可以看出，D-半乳糖導致模型組小鼠體內SOD活性明顯降低，而MDA產量增加，說明小鼠體內發生過氧化，建模成功。通過PA、PC、PB、PW的治療后，過氧化得到了有效控制，尤其是PA組和PW組，與陽性對照組治療效果接近，與模型組有顯著差異（p＜0.01），這與體外的結果相一致。PC和PB治療效果稍差。

圖2　大葉苦丁茶提取物對小鼠血清中SOD和MDA活力的影響Fig.2　Effect of Kudingcha extracts on SOD and MDA activity in mice

3　結論

大葉苦丁茶以其食藥兩用，而一直被用作傳統的保健茶飲品。其活性成分包括多酚類、多糖類、黃酮類及多種微量元素。但是傳統的提取方法繁復，原料利用效率低。采用不同極性的溶劑分級提取，既降低了成本，也提高了原料的利用率。此外，還比較研究了不同的提取物體內和體外的抗氧化活性，結果表明乙酸乙酯、氯仿、正丁醇和水萃取組分均具有一定的抗氧化活性，通過成分鑒定，發現乙酸乙酯萃取物中含有多酚和黃酮類物質，而氯仿萃取物中含有蛋白質類和生物堿，水提物中含有多糖和蛋白質。本文為大葉苦丁茶在工業上的應用提供了研究基礎，具有很廣闊的應用前景。

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Comparison of the antioxidant activity of different extracts from Ilex Kudingcha C.J.Tsing

JIN Ya-xiang，SUN Jing，LI Hong-jun*
（China-Japan Union Hospital of Jilin University，Jilin University，Changchun 130033，China）

Ilex Kudingcha C.J.Tsing was a traditional tea drinks both edible and medicinal，containing a variety of active components.In order to improve the extraction efficiency of kudingcha，85%ethanol was used as solvent，and were followed by liquid-liquid extraction with equal volume of petroleum ether，ethyl acetate，chloroform and n-butanol，respectively.The petroleum ether component（PS），the acetate component（PA），chloroform component（PC），n-butanol component（PB）and the remaining portion of the water-soluble（PW）were obtained.They were identified by chemical methods and the anitoxidant activity of which were investigated both in vivo and in vitro.Results showed that the main component of ethyl acetate were phenols and flavonoids，chloroform extraction components were protein and alkaloids，n-butanol extract were protein substances，and the aqueous phase containing mainly protein and sugar，respectively.PA could significantly scavenge the DPPH free radical when the concentration was 100mg/mL，the highest removal rate was 50% followed by PW，PC and PB.In addition，PA and PW could significantly increase the activity of SOD，decreased the production of MDA in serum in vivo.

Ilex Kudingcha C.J.Tsing；antioxidant activity；fractional extraction

TS272.5

A

1002-0306（2015）04-0151-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.024

2014－05－26

金亞香（1962-），女，博士，護師，研究方向：康復保健與活性物質研究。

李洪軍（1960-），男，博士，教授，研究方向：康復保健與活性物質研究。