一種適宜分離純化虎杖中白藜蘆醇的大孔樹脂的修飾研究

李祚丹，季金茍，劉　莉，陳園園，何　慧，徐　溢，穆小靜

（重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院藥學(xué)系，重慶400044）

一種適宜分離純化虎杖中白藜蘆醇的大孔樹脂的修飾研究

李祚丹，季金茍*，劉莉，陳園園，何慧，徐溢，穆小靜

（重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院藥學(xué)系，重慶400044）

以制備一種更適宜分離純化白藜蘆醇的大孔吸附樹脂為研究目標。在五種大孔吸附樹脂中，篩選出了NKA-II大孔吸附樹脂，將其氯甲基化后再接枝苯胺，得NKA-II-苯胺，將NKA-II和NKA-II-苯胺樹脂對白藜蘆醇的吸附和解吸進行對比研究。NKA-II-苯胺樹脂對白藜蘆醇的吸附和解吸性能有明顯的增強，當上樣溶液pH=4，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為0.10mg·mL-1，吸附時間為300min，以乙醇60%解吸時，其對白藜蘆醇的吸附率由87.62%提高到95.85%，解吸率由88.75%提高到92.19%。說明新制備的NKA-II-苯胺樹脂更適宜分離純化白藜蘆醇。

虎杖，白藜蘆醇，大孔吸附樹脂，接枝，分離純化

白藜蘆醇為多年生草本植物虎杖的重要活性物質(zhì)之一[1-2]，屬天然的抗氧化劑，有多種藥理活性，如降低血液粘稠度，抑制血小板凝結(jié)、血管舒張，保持血液暢通，預(yù)防癌癥的發(fā)生及發(fā)展，抗動脈粥樣硬化和冠心病等[3]。目前，從虎杖中分離純化白藜蘆醇的方法主要有氧化鋁柱層析法、硅膠柱層析法、聚丙烯酸樹脂和大孔樹脂法等。相比而言，大孔樹脂具有比表面積大、吸附容量高、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、節(jié)省費用等諸多優(yōu)點[4-6]，因而是目前的研究熱點。本文探索了不同大孔吸附樹脂對白藜蘆醇的吸附和解吸情況，篩選出最優(yōu)的大孔吸附樹脂，并在其結(jié)構(gòu)上進行接枝修飾，進一步考察了修飾后樹脂對白藜蘆醇的吸附和解吸性能，以期找到一種更為適宜的大孔吸附樹脂，為工業(yè)化生產(chǎn)白藜蘆醇奠定一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白藜蘆醇標準品純度：99%，陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號：BL121020-1；虎杖莖根重慶科瑞南海制藥有限公司；AB-8、NKA-II、NKA-9、D101、H103大孔吸附樹脂南開大學(xué)化工廠；無水乙醇、鹽酸AR，川東化工集團化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉AR，成都市科龍化工試劑廠。

T6型新世紀紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；THZ-C型恒溫振蕩箱江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海嘉鵬科技有限公司；Tecrai 10型掃描電子顯微鏡荷蘭Philips公司；5DX/550Ⅱ型傅里葉-紅外光譜儀美國Nicolet公司；Phs-3C型精密pH計上海雷磁儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1白藜蘆醇提取液的制備稱取20.00g虎杖粗粉，每次以200mL 75%乙醇在60℃下加熱回流3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇得濃縮液，在濃縮液中加入pH=2的30%的乙醇進行醇沉，靜置過夜，減壓抽濾得不溶物為大黃素的粗提物，溶解物即為白藜蘆醇提取液[7]，備用。

1.2.2對照品溶液的制備與標準曲線的建立精密稱取白藜蘆醇標準品0.0300g，用30%乙醇溶解，配成白藜蘆醇質(zhì)量濃度為6.00μg·mL-1的對照品儲備液，分別取2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL對照品儲備液加入到10mL容量瓶中，以30%乙醇定容。

以30%乙醇溶液為參比，在190～600nm范圍內(nèi)進行光譜掃描。在最大吸收波長處，以吸光度-質(zhì)量濃度繪制標準曲線，求線性回歸方程。

1.2.3大孔吸附樹脂的預(yù)處理將AB-8、NKA-II、NKA-9、D101和H103五種樹脂各取適量，分別用乙醇浸泡24h，放出浸液，用乙醇洗至流出液與水1∶5混合不渾濁，以水洗至無醇味。再用5%HCl通過樹脂柱，浸泡2～4h，水洗至中性，2%NaOH通過樹脂柱，浸泡2～4h，水洗至中性，備用。

1.2.4不同型號大孔吸附樹脂對白藜蘆醇分離效果的影響準確稱取上述預(yù)處理后的樹脂（去表面水分）1.00g，置于具塞錐形瓶中，再加入0.10mg·mL-1白藜蘆醇提取液50.00mL，30℃下振蕩吸附24h，測定溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，計算吸附率（De，%）。將吸附后樹脂過濾，以50.00mL 60%乙醇振蕩解吸24h，測定解吸液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，計算解吸率（Dd，%），選取最優(yōu)的大孔吸附樹脂進行修飾研究。De和Dd按下式計算：

式中：ρ0吸附前溶液質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；ρ1吸附后溶液質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；ρ2解吸液質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；V1樣品溶液體積（mL）；V2解吸液體積（mL）。

1.2.5樹脂的修飾鑒于白藜蘆醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有典型的酚羥基，本研究設(shè)計在篩選出的樹脂中引入能與酚羥基形成氫鍵的氨基，以增強其選擇吸附性[8]。

1.2.5.1氯甲基化反應(yīng)以常規(guī)的Friedel-Craft氯甲基化反應(yīng)在樹脂骨架中引入氯甲基（—CH2Cl）[9]。反應(yīng)過程如下：取預(yù)處理過的大孔吸附樹脂50g，加入到帶有攪拌器、溫度計和回流冷凝器的三口瓶中，再加入250mL氯甲醚。室溫下靜置4h后開始攪拌，分兩次加入75g無水氯化鋅，在50～52℃反應(yīng)8h。冷卻至室溫，濾出氯化母液，以甲醇反復(fù)洗凈反應(yīng)后制得的產(chǎn)物，抽濾，得氯甲基化大孔吸附樹脂（簡稱氯球）。

1.2.5.2接枝苯胺向裝有電動攪拌器、回流冷凝管和溫度計的三口瓶中，加入DMF溶脹的氯球50g，適量苯胺，升溫至60℃，攪拌20h。反應(yīng)完成后冷卻過濾，以乙醇洗滌后再抽提8h，晾干，即得樹脂的苯胺修飾產(chǎn)物。

1.2.5.3修飾后大孔樹脂的表征用傅里葉紅外光譜儀對修飾后的大孔樹脂進行結(jié)構(gòu)分析，用掃描電子顯微鏡觀察其形貌。

1.2.6吸附等溫線配制系列不同濃度的白藜蘆醇提取液。準確稱取修飾前后的樹脂各2.00g分別加入到錐形瓶中，各取以上白藜蘆醇溶液50.00mL，分別加入到錐形瓶中，30℃下振搖吸附24h后，測定此時溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度以計算De。

1.2.7pH對吸附率的影響取相同濃度的白藜蘆醇提取液，將其pH分別調(diào)至3、4、5、6、7。準確稱取修飾前后的兩種樹脂各2.00g分別加入到錐形瓶中，各取以上白藜蘆醇溶液50.00mL，分別加入到錐形瓶中，30℃下振搖吸附24h，使其達到吸附平衡。測定此時各溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度以計算De。

1.2.8最佳靜態(tài)吸附時間準確稱取修飾前后的兩種樹脂各2.00g分別加入到錐形瓶中，取白藜蘆醇提取液50.00mL，加入到錐形瓶中，30℃下振搖吸附，每30min取樣一次，測定各溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度以計算樹脂對白藜蘆醇的De。將吸附飽和的大孔樹脂懸浮液離心，棄去上清，將樹脂自然晾干，留待備用。

1.2.9乙醇濃度對解吸率的影響取1.2.8項下留待備用的達吸附平衡的干燥樹脂等量于不同帶塞錐形瓶中，再分別加入50.00mL不同濃度的乙醇溶液，30℃振搖解吸24h，測定此時溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度并計算Dd。

2　結(jié)果與分析

2.1白藜蘆醇的標準曲線的建立

通過光譜掃描確定白藜蘆醇的檢測波長為306nm，以對照品質(zhì)量濃度X（μg·mL-1）為橫坐標，吸光度Y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=0.1413X+ 0.0217，r=0.9996，白藜蘆醇在1.26～5.51μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2大孔吸附樹脂的篩選

表1為五種不同的大孔吸附樹脂對白藜蘆醇的吸附、解吸性能的比較，綜合考慮五種大孔吸附樹脂對白藜蘆醇的De和Dd，NKA-II樹脂最適宜用來分離純化白藜蘆醇。

表1　大孔吸附樹脂的篩選（n=3）Table.1　Macroporous resin type of screening（n=3）

2.3NKA-II苯胺修飾后產(chǎn)物的表征

2.3.1紅外光譜表征圖1為NKA-II與NKA-II苯胺修飾后（NKA-II-苯胺）樹脂的紅外圖譜。從圖1的a、b圖譜對比可以看出，光譜曲線a在3442.1cm-1的吸收峰為NKA-II樹脂的功能基羥基的O-H伸縮振動；樹脂氯甲基化后再接枝苯胺，分子中引入氨基，會形成分子間和分子內(nèi)氫鍵，氫鍵的形成使電子云密度平均化體系能量下降，吸收峰向低波數(shù)位移，并使吸收強度加強，光譜曲線b中，在3417cm-1處會出現(xiàn)較強的吸收峰；再者在b中1223.7cm-1處的吸收峰為分子中的脂肪族仲胺基的特征峰，系樹脂氯甲基化后再接枝苯胺所引入，綜合以上信息可知苯胺已被成功引入NKA-II樹脂中。

圖1　NKA-II樹脂與NKA-II-苯胺樹脂的紅外圖譜Fig.1　FT-IR spectra of NKA-II and NKA-II-aniline resin注：a：NKA-II樹脂；b：NKA-II-苯胺樹脂；圖2同。

2.3.2掃描電子顯微鏡表征圖2為NKA-II與NKAII-苯胺樹脂的掃描電子顯微鏡圖譜（SEM），從圖2的a，b圖譜比較可以看出，兩者的形貌幾乎沒有變化，可見在NKA-II上接枝苯胺后，并沒有破壞NKA-II大孔吸附樹脂的原有結(jié)構(gòu)。

圖2　NKA-II樹脂與NKA-II-苯胺樹脂的掃描電鏡圖譜Fig.2　SEM of NKA-II and NKA-II-aniline resin

2.4NKA-II-苯胺和NKA-II樹脂對白藜蘆醇分離純化效果的比較

2.4.1吸附等溫線圖3為NKA-II樹脂和NKA-II-苯胺樹脂對白藜蘆醇吸附等溫線的比較。在各濃度項下，NKA-II-苯胺樹脂對白藜蘆醇的吸附率明顯強于NKA-II樹脂，可見苯胺的引入，明顯增強了其對白藜蘆醇的吸附。在0.10mg·mL-1時，兩者的吸附率均達到最大，故在實驗中提取液的白藜蘆醇質(zhì)量濃度取0.10mg·mL-1。

圖3　吸附等溫線（n=3）Fig.3　Adsorption isotherms（n=3）

2.4.2pH對吸附率的影響圖4為在白藜蘆醇質(zhì)量濃度為0.10mg·mL-1時，pH對NKA-II和NKA-II-苯胺樹脂吸附白藜蘆醇的影響。由圖4可知，在各pH項下，NKA-II-苯胺對白藜蘆醇的吸附率都明顯大于NKA-II；在pH=4時，NKA-II-苯胺樹脂的吸附率達到最大，為95.87%，而NKA-II樹脂的最大吸附率出現(xiàn)在pH=5，這時的吸附率為87.73%。

圖4　pH對吸附率的影響（n=3）Fig.4　Effect of pH on adsorption rate（n=3）

2.4.3最佳靜態(tài)吸附時間圖5為NKA-II和NKAII-苯胺大孔吸附樹脂分別在pH=5和pH=4時對白藜蘆醇的吸附動力學(xué)曲線。由圖5可知，NKA-II-苯胺總吸附量增大，其對白藜蘆醇的吸附速率也有一定的提高，在300min時，吸附基本達到平衡狀態(tài)，吸附率為95.85%，此時NKA-II樹脂對白藜蘆醇的吸附率為87.62%。故最佳靜態(tài)吸附時間為300min。

圖5　吸附動力學(xué)曲線（n=3）Fig.5　Adsorption kinetics curves（n=3）

2.4.4乙醇濃度對解吸率的影響圖6為乙醇濃度對NKA-II和NKA-II-苯胺樹脂解吸白藜蘆醇的影響。由圖6可知，隨著乙醇濃度的增大，大孔樹脂對白藜蘆醇的解吸率逐漸增強。當乙醇濃度為60%時，兩種樹脂對白藜蘆醇的解吸基本達到平衡狀態(tài)，解吸率分別為88.75%和92.19%，可見NKA-II-苯胺樹脂的解吸性能優(yōu)于NKA-II樹脂。

3　結(jié)論

綜合考慮五種大孔吸附樹脂對白藜蘆醇的吸附率和解吸率，NKA-II樹脂最適宜用來分離純化白藜蘆醇。對NKA-II樹脂進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，將其氯甲基化，再接枝苯胺，引入了可與白藜蘆醇分子中的羥基形成氫鍵的仲胺鍵。對白藜蘆醇的吸附和解吸性有了明顯的增強，當樣品溶液溶液pH=4，白藜蘆醇質(zhì)量濃度為0.10mg·mL-1，吸附時間為300min，乙醇60%解吸時，其對白藜蘆醇的吸附率由87.62%提高到95.85%，解吸率由88.75%提高到92.19%。可見NKAII-苯胺樹脂更適宜用于白藜蘆醇的分離純化。

圖6　乙醇濃度對解吸率的影響（n=3）Fig.6　Effect of ethanol concentration on the desorption rate（n=3）

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Modification of the macroporous resin for purifying resevratrol in Polygonum cuspidatum

LI Zuo-dan，JI Jin-gou*，LIU Li，CHEN Yuan-yuan，HE Hui，XU Yi，MU Xiao-jing
（Faculty of Pharmacy，College of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China）

To synthesize a more suitable macroporous resin for purifying resevratrol in Polygonum cuspidatum. The best resin NKA-II，selected in five kinds of macroporous resins by their adsorption and desorption properties to resevratrol，was chloromethylated and grafted with aniline.After purifying the sample extract with NKA-II-aniline resin，the adsorption and desorption capacity to resveratrol were obviously enhanced.When the sample extract at pH=4，the concentration of resveratrol was 0.10mg·mL-1，adsorption time of 300min and elute solution of 60%ethanol，the adsorption rate increased from 87.62%to 95.85%，the desorption rate increased from 88.75%to 92.19%.The results indicated that the new NKA-II-aniline resin may be a promising macroporous resin for the separation and purification of resveratrol in Polygonum cuspidatum.

Polygonum cuspidatum；resveratrol；macroporous resin；modification；purification

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0140-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.021

2014－05－12

李祚丹（1989-），女，碩士研究生，研究方向：天然藥物提取。

季金茍（1962-），男，博士，教授，研究方向：藥物化學(xué)。

重慶市墊江縣“121”醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)科技支持示范工程項目（2012-2015）；重慶市科技攻關(guān)（一般）計劃項目（CSTC：2011AC5071）。