桂圓中兒茶素類成分提取及HPLC與紅外光譜法分析

趙　麗，陳衛中，李　玲，張　楠，劉　新，韓　琴

（成都醫學院公共衛生系，四川成都610083）

桂圓中兒茶素類成分提取及HPLC與紅外光譜法分析

趙麗，陳衛中，李玲，張楠，劉新，韓琴*

（成都醫學院公共衛生系，四川成都610083）

目的：研究了桂圓皮中兒茶素類成分超聲波提取工藝，并對桂圓皮、肉及核中兒茶素類成分沒食子酸（GA）、兒茶素（-C）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）進行定性、定量分析。方法：采用Box-Behnken Design實驗考察甲醇體積分數、料液比和桂圓皮粉碎度三因素對桂圓皮中兒茶素類成分提取的影響，優化最佳提取工藝參數。用HPLC與紅外光譜法對桂圓中兒茶素類成分進行分析和定量，確定其兒茶素類成分類型及含量。結果：最佳提取工藝參數為甲醇體積分數51%、料液比1∶30g/mL和桂圓皮粉碎度90目。桂圓皮兒茶素單體類型及含量：EC為0.786mg/g，ECG為0.33mg/g，-C為0.246mg/g，EGCG為0.163mg/g，GA為0.0387mg/g；桂圓核：EC為3.19mg/g，ECG為1.019mg/g，GA為0.385mg/g，EGCG為0.178mg/g。結論：紅外光譜法證實：桂圓皮、核含有兒茶素類單體成分或其單體的聚合體。為桂圓兒茶素類成分有效開發提供一定的理論基礎。

桂圓，兒茶素，響應面法，HPLC，紅外光譜

桂圓（Dimocarpus longan Lour.），又稱龍眼，歸屬無患子科，為亞熱帶水果，盛產于中國、泰國、中國臺灣、印度和菲律賓等東南亞各國。在中國，人們不僅把桂圓作為營養豐富的水果來享用，而且其肉、核、皮以其安神，提高免疫力、降血壓、緩解神經疼痛和腫脹等藥效作為中藥材被廣泛使用[1-3]。研究發現，桂圓核甲醇提取物對小白鼠的記憶學習功能有明顯的促進作用，對結腸癌320DM、SW480和HT-29細胞增殖有抑制作用，并誘導其細胞凋亡[4-5]。其皮高壓輔助提取物對HepG2、A549和SGC7901腫瘤細胞株具有抗癌活性作用[6]。用100、250、400mg/kg劑量桂圓核提取物喂食小白鼠4周和13周時間，均未觀察到對其毒副作用[7]。研究表明，桂圓皮、核的甲醇提取物中含有沒食子酸、表兒茶素、沒食子酸甲酯、柯里拉京、原花青素A、原花青素B2、老鸛草素、短葉蘇木酚酸甲酯、訶黎勒鞣花酸、蛇莓苷、野桐酸、鞣花酸等多種抗氧化多酚類物質及槲皮素-3-鼠李糖、龍眼內酯和多糖-蛋白復合物等活性物質[2，8-10]。而其中的沒食子酸、表兒茶素、原花青素A和原花青素B2等成分均屬于黃烷-3-醇類化合物，該類化合物具有較好的生物學活性，已被證實有抗氧化活性、調節免疫、防癌、抗癌、抗菌、抗病毒、防輻射等功能。目前，現有文獻中對桂圓皮、肉和核中黃烷-3-醇兒茶素類成分除了沒食子酸（GA）、表兒茶素（EC）報道以外，其他成分缺乏相應的報道，尤其是其兒茶素（-C）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）成分。本研究通過響應面法優化出的桂圓皮中兒茶素類成分超聲波提取最佳工藝參數，在最佳參數條件下對桂圓皮、肉和核中兒茶素類成分進行超聲提取，采用HPLC法對其兒茶素類成分沒食子酸（GA）、兒茶素（-C）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）進行定性、定量分析。同時，運用紅外光譜技術為其含有兒茶素類成分提供光譜學依據，為桂圓兒茶素類成分有效開發提供理論參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

桂圓產地：成都瀘縣，分離果皮，果肉，果核，干燥，粉碎，分別過20、40、60、80和100目標準篩，4℃避光，貯存備用；沒食子酸（GA）、兒茶素（-C）、表沒食子兒茶素沒食子酸（EGCG）、表兒茶素（EC）和表兒茶素沒食子酸（ECG） 化學對照品，成都普瑞法科技有限公司，HPLC≥98%；甲醇色譜純，Fisher Scientific，USA；溴化鉀光譜純，天津市光復精細化工研究所；磷酸分析純，成都市科龍化工試劑廠；實驗用水為去離子超純水。

高效液相色譜儀日立（UV Detector：L-2400，pump：L-2130），日本株式會社日本高新技術那珂事業所；JY92-IIN型超聲波細胞粉碎機20～50kHZ頻率自動跟蹤，6Φ變幅桿，寧波新芝生物科技有限公司；TJ270-30A型紅外光譜儀天津拓普儀器有限公司；S04H型超聲清洗機廈門儀器有限公司；BSA124S型電子天平北京賽多利斯系統有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1兒茶素類物質提取流程稱取過篩桂圓皮、桂圓肉、桂圓核各1.0g→一定條件下超聲波破碎提取兒茶素類物質→提取液離心、過濾→高效液相色譜定量。

1.2.2單因素實驗

1.2.2.1料液比對兒茶素物質提取的影響稱取過40目標準篩的桂圓皮1.0g，在超聲波功率為200W、超聲時間為30min、甲醇體積分數50%條件下，以兒茶素類物質總含量為目標，考察料液比1∶6、1∶12、1∶16、1∶20和1∶30（g/mL）對其兒茶素類物質提取的影響程度，確定響應面實驗優化范圍。

1.2.2.2粉碎度對兒茶素類物質提取的影響稱取過40目標準篩的桂圓皮1.0g，在超聲波功率為200W、超聲時間為30min、甲醇體積分數50%、料液比1∶30條件下，以兒茶素類物質總含量為目標，考察桂圓皮粉碎度10、20、40、60和100目對其兒茶素類物質提取的影響程度，確定響應面實驗優化范圍。

1.2.2.3甲醇體積分數對兒茶素類物質提取的影響稱取過60目標準篩的桂圓皮1.0g，在超聲波功率為200W、超聲時間為30min、料液比1∶30條件下，以兒茶素類物質總含量為目標，考察甲醇體積分數0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%對其兒茶素類物質提取的影響程度，確定響應面實驗優化范圍。

1.2.3響應面法優化桂圓皮兒茶素類物質超聲波提取工藝在單因素的基礎上，以超聲波功率為200W、超聲提取時間為30min作為固定因素，用Box-Behnken Design實驗來考察甲醇體積分數、料液比和桂圓皮粉碎度三因素對桂圓皮兒茶素類物質提取影響程度，建立多元二次回歸方程，在其基礎上優化出最佳提取工藝條件參數。實驗設計因素水平表如表1所示。

表1　因素與水平表Table.1　The factors and levels table

1.2.4HPLC標準曲線方程建立色譜條件：色譜柱Allsphere ODS-25U柱（4.6mm×250mm，5μm）；檢測波長：λ=278nm；流速為1mL/min；柱溫為30℃；進樣量為10μL。流動相A為含0.1%磷酸的甲醇溶液，流動相B為含0.1%磷酸的水溶液。流動相洗脫梯度：流動相A在0～5min內，從0%增加到30%；5～11min，從30%降低到18%；11～25min從18%增加到50%；25～27min，保持在50%不變[11]。

精確稱取GA、-C、EGCG、EC、ECG的對照品各10mg，分別用甲醇定容至1mL，搖勻，制成濃度均為10mg/mL的標準品儲備液。分別精密量取儲備液各100μL，混合并定容至1mL，得到濃度為1000μg/mL的標準品混合液，稀釋成62.5、125、250、500μg/mL四個濃度梯度標準品儲備液，再過0.45μm濾膜，在色譜條件下進樣10uL，以各組分質量（W）為橫坐標，對應峰面積（A）為縱坐標作圖，得到回歸方程。

分別稱取過90目標準篩的桂圓皮、肉、核各1g，在優化出的最佳超聲波輔助提取工藝條件下，超聲破碎提取兒茶素1次，經過3000r/min離心3min，取其上清液過0.45um濾膜，在給定色譜檢測條件下進樣各3次，分析比較桂圓皮、肉和核中兒茶素GA、-C、EGCG、EC、ECG單體類型及含量。

1.2.5桂圓皮、核紅外光譜分析稱取過90目標準篩的桂圓皮、核各2mg，分別與200mg溴化鉀粉末混合研磨、壓片，在4000～400cm-1波數范圍內進行紅外光譜掃描，通過其紅外光譜圖分析兒茶素類物質基團結構和類型。

2　結果與分析

2.1響應面實驗結果與最佳提取工藝參數

2.1.1單因素實驗

2.1.1.1料液比的影響從圖1可以看出，桂圓皮中兒茶素類物質含量隨著料液比的增大而呈現增高的趨勢，說明甲醇提取溶劑體積的加大有利于兒茶素類物質的溶出，但考慮到樣品濃縮時間、耗能成本及超聲波細胞破碎儀變幅桿參數要求，所以選擇料液比為1∶30。

圖1　不同料液比對兒茶素類物質含量提取效果Fig.1　Effect of the ratio of solve to material on the contents of catechins

2.1.1.2粉碎度的影響圖2顯示，其兒茶素類物質含量隨著粉碎度目數的增加而呈現增高趨勢，當粉碎度目數增大到40目時，呈緩慢上升趨勢，這可能是由于桂圓皮粉碎過細，溶出的兒茶素類物質由于桂圓皮粉末靜電作用而被吸附，進而不利于其溶入提取溶液中，故選擇粉碎度為60目。

圖2　不同粉碎度對兒茶素類物質含量提取效果Fig.2　Effect of the smash degree on the on the contents of catechins

2.1.1.3甲醇體積分數的影響圖3、圖4表明，桂圓皮中兒茶素類物質在溶于10%與50%這兩個甲醇體積分數時，其含量相對的最高。控制好甲醇體積分數可有助于其兒茶素類單體成分物質的提取。當甲醇體積分數為10%時，雖然桂圓皮中兒茶素類物質總體含量較高，但是其EC成分含量較高，相比于甲醇體積分數為50%時，其提取物中其他兒茶素單體含量較少，且只檢測到4種兒茶素單體成分，所以選擇甲醇體積分數為50%。

圖3　不同甲醇體積分數對兒茶素類物質含量提取效果Fig.3　Effect of the concentrations of methyl alcohol on the contents of catechins

2.1.2Box-Behnken Design實驗組合及結果以Box-Behnken Design實驗方案為基礎，對考察因素和其水平進行設計，共17組實驗條件組合，以HPLC法檢測桂圓皮中兒茶素類物質總含量作為響應值，得到17組實驗結果，見表2。

2.1.3回歸方程構建及擬合度分析在Box-Behnken Design實驗結果基礎上構建甲醇體積分數、料液比和桂圓皮粉碎度三因素對桂圓皮兒茶素類物質提取工藝參數的多元二次方程模型，模型方差及擬合結果見表3。回歸模型F檢驗顯著（p＜0.0001）；失擬項F檢驗在α=0.05水平不顯著（p＞0.05），調整后R2=0.9860，預測R2=0.9397，信噪比=44.313，表明該模型擬合較好，可用于桂圓皮中兒茶素類物質提取條件的參數評價和優化。

多元二次方程如下：

Y兒茶素總含量（mg/g）=1.48+0.026A+0.032B+3.019×10-3C-0.021AB-3.275×10-3AC+8.712×10-3BC-0.049A2-0.013B2-5.509×10-3C2

2.1.4響應面分析及最佳提取條件參數優化當檢驗水準取α=0.05時，AC對桂圓皮兒茶素物質總量提取呈不顯著影響（p=0.1810），所以對其交互作用不做分析。

如圖5所示，當C因素（粉碎度）為93.1476目時，兒茶素類物質的含量隨著A因素（甲醇體積分數）和B因素（料液比）的增大而增高，直到甲醇體積分數為51.0432%時，其兒茶素類物質的含量達到最大值1.51（mg/g），之后隨著甲醇體積分數的升高而出現下降趨勢。因此，控制好甲醇體積分數有助于桂圓皮中兒茶素含量的提取；當A因素（甲醇體積分數）為51.0432%時，其兒茶素類物質含量隨著B因素（料液比）的增加而呈現明顯增加的趨勢（p＜0.0001），而C因素（粉碎度）對其兒茶素類物質的含量提取影響程度較小，呈現平緩上升趨勢。

表2　Box-Behnken Design實驗設計及結果Table.2　Box-Behnken Design and results

表3　方差分析及顯著性檢驗Table.3　Variance analysis and significance tests

2.1.5優化最佳提取條件參數組合及驗證在超聲波功率為200W、超聲時間為30min條件下，在多元二次回歸方程基礎上以最大兒茶素類物質含量1.51（mg/g）為目標值，得到超聲波輔助提取桂圓皮中兒茶素類物質最佳提取工藝參數組合：甲醇體積分數51.0432%、料液比1∶29.9999g/mL和桂圓皮粉碎度93.1476目。為了便于實際應用對相關參數做了調整為：甲醇體積分數51%、料液比1∶30g/mL和桂圓皮粉碎度90目。驗證實驗，最佳條件下的兒茶素物質總含量為1.48（mg/g），與模型預測值1.51（mg/g）接近。

2.2桂圓中兒茶素類成分HPLC分析

按1.2.4方法，分別對不同濃度的GA、-C、EGCG、EC、ECG對照品進行線性擬合，得到方程如表4所示。

對照品混合液5種單體在給定的色譜條件下分離情況良好，Rf＞1.2，可用來對樣品中的5種兒茶素單體進行成分分析和定量，其譜圖如圖6所示。

圖6　兒茶素類對照品（a）與桂圓皮（b）、桂圓肉（c）和桂圓核（d）中的兒茶素類提取物的色譜圖Fig.6　Graphs of HPLC separation for catechins standers（a）and other graphs for peel（b），flesh（c）and seed（d）of longan，respectively

由圖6可以看出，桂圓皮中除了含有所檢測的5種單體外，還有很多其他植物活性物質，其物質有待于進一步研究和定量。桂圓肉在本次檢測中只含有微量的兒茶素單體GA，故不用紅外光譜法來對其兒茶類成分進行分析。桂圓核除-C沒有檢測出外，其他4種單體都被很好的分離出，而且其含量均高于桂圓皮中對應的單體含量，見表5。

表5　桂圓皮與桂圓核中兒茶素單體類型及其含量Table.5　The styles and contents of catechins for peel and seed of longan

由表5可知，桂圓皮與桂圓核中兒茶素5種單體中EC含量最高，桂圓皮中兒茶素單體含量由高向低為：EC為0.786mg/g，ECG為0.33mg/g，-C為0.246mg/g，EGCG為0.163mg/g，GA為0.0387mg/g；桂圓核中兒茶素單體含量由高向低為：EC為3.19mg/g，ECG為1.019mg/g，GA為0.385mg/g，EGCG為0.178mg/g。

2.3桂圓皮與桂圓核兒茶素類物質紅外光譜分析

由于1400～700cm-1波數為其基團指紋區，且成分復雜，故將1800～700cm-1區域紅外光譜進行二階微分計算，使光譜吸收峰信號增強，以便相對完全反映桂圓皮和桂圓核所含成分[12]。

圖7顯示，桂圓皮與桂圓核光譜中吸收峰均含有酚類分子-O-H的伸縮振動吸收峰（3356.00cm-1）、-O-H彎曲振動與醚上的-C-O伸縮振動吸收峰（1325～1341cm-1，1226～1202cm-1）、-C=O伸縮振動吸收峰（1660～1690cm-1）、-C=C伸縮振動吸收峰（1655～1604cm-1）、CH2變形振動吸收峰（1332.00cm-1）、苯環伸縮振動吸收峰（1619、1510、1459cm-1）和二取代苯上的=C-H（782～764cm-1）變形振動吸收峰，與兒茶素類物質骨結構振動架一致而形成[1，12-14]。說明桂圓皮、核中含有兒茶素類單體成分或其單體的聚合體。

圖7　桂圓皮（a）與桂圓核（b）紅外光譜圖Fig.7　FTIR spectra of peel（a）and seed（b）of longan

研究顯示，兒茶素類對照品GA的特征吸收峰波數為1702cm-1；-C的特征吸收峰波數為1643、1518、819、780、765cm-1；EC的特征吸收峰波數為1518、1469、1112、796cm-1；由于ECG、EGCG分子結構中有酯基存在，故在1681cm-1和1692cm-1處各有一個特征吸收峰[13，15]。

與兒茶素類對照品特征峰對比，發現其特征峰在桂圓皮、核的紅外光譜中均能找出。桂圓皮二階導數光譜中具有GA特征吸收峰（1702cm-1）；-C特征吸收峰（1647、1511、818、781、764cm-1）；EC特征吸收峰（1511、1468、1111、795cm-1）；EGCG特征吸收峰（1693cm-1）；ECG特征吸收峰（1686cm-1）。桂圓核二階導數光譜中具有GA特征吸收峰（1707cm-1）；-C特征吸收峰（1647、1510、819、779、763cm-1）；EC特征吸收峰（1510、1468、1112、792cm-1）；EGCG特征吸收峰（1691cm-1）；ECG特征吸收峰（1685cm-1）。進一步證實了：桂圓皮中和桂圓核中存在兒茶素類物質的單體或聚合體成分。從桂圓核光譜圖上可以看出其核應該還有-C成分，而在HPLC圖中未發現，可能是由于桂圓核中-C與EC聚合成多聚體原花青素的緣故，故在桂圓核紅外光譜圖可以發現代表原花青素二聚體的特征吸收峰（1520、1150、1139cm-1）[13]。

3　結論

應用響應面法對桂圓皮中兒茶素類物質超聲波提取工藝進行優化及多元二次模型的構建。在超聲波功率為200W、超聲時間為30min條件下，桂圓皮中兒茶素超聲波最佳提取工藝參數為：甲醇體積分數51%、料液比1∶30g/mL和桂圓皮粉碎度90目。在最佳提取條件下，分別對桂圓皮、肉及核的兒茶素類物質進行提取，其提取物通過HPLC法來定量分析，得出桂圓皮中EC為0.786mg/g，ECG為0.33mg/g，-C為0.246mg/g，EGCG為0.163mg/g，GA為0.0387mg/g；桂圓核中EC為3.19mg/g，ECG為1.019mg/g，GA為0.385mg/g，EGCG為0.178mg/g。通過紅外光譜法證實了桂圓皮與桂圓核存在兒茶素類物質的單體或聚合體，且含有大量的-C與EC聚合物原花青素多聚體成分，為其黃烷-3-醇類兒茶素類及原花青素類成分有效開發提供光譜學依據。

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Study on extraction and determination of contents of catechins by the methods of HPLC and FTIR spectroscopy from longan

ZHAO Li，CHEN Wei-zhong，LI Ling，ZHANG Nan，LIU Xin，HAN Qin*
（Department of Public Health，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China）

Objective：To study the ultrasonic-assisted extraction of catechins from longan and identification and quantification of the contents of catechins，including gallic acid，catechin，epigallocatechin-gallate，epicatechin and epicatechin-gallate，were studied from peel，flesh and seed of longan.Methods：Box-Behnken design（BBD）was applied to evaluate the effects of three independent variables（methanol concentrations，the ratio of solvent to material and the smash degree）on total catechins of of longan peel.Identification and quantification of the contents of catechins were investigated by the methods of HPLC and FTIR spectroscopy in longan. Results：The results showed that the optimal conditions were as follows：methanol concentrations were 51%，the ratio of solvent to material was 1∶30g/mL and the smash degree was 90mu with the ultrasonic extraction method. The contents of catechins showed that epicatechin was 0.786mg/g，epicatechin-gallate was 0.33mg/g，catechin was 0.246mg/g，epigallocatechin-gallate was 0.163mg/g and gallic acid was 0.0387mg/g in longan peel and other results showed that epicatechin was 3.19mg/g，epicatechin-gallate was 1.019mg/g，gallic acid was 0.385mg/g and epigallocatechin-gallate was 0.178mg/g in longan seed，respectively.Conclusion：It was confirmed that different structural units of catechins and polymeric compounds by means of FTIR spectroscopy in longan.These result set the theoretical foundation for the development and utilization of catechins from longan.

longan；catechins；response surface methodology；HPLC analysis；FTIR spectroscopy

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0126-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.018

2014－05－08

趙麗（1990-），女，本科生，研究方向：植物中活性物質提取。

韓琴（1982-），女，碩士，實驗師，主要從事預防醫學實驗教學和營養保健與免疫方面的研究。

四川省大學生創新訓練計劃項目（201313705014）；成都醫學院學科建設項目（CYXK2012010）；成都醫學院自然科學基金（CYZ11-019）。