脫脂豆粕變性程度對于產(chǎn)物分離蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)及貯藏穩(wěn)定性影響

郭鳳仙，何志勇，黃小林，熊幼翎，陳　潔，2，*

（1.江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無錫214122）

脫脂豆粕變性程度對于產(chǎn)物分離蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)及貯藏穩(wěn)定性影響

郭鳳仙1，何志勇1，黃小林1，熊幼翎1，陳潔1，2，*

（1.江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無錫214122）

為研究不同變性程度的原料所制備的大豆分離蛋白（SPI）貯藏穩(wěn)定性及其與蛋白結(jié)構(gòu)的關(guān)系，實驗分別以三批不同變性程度（72.6%，29.4%和1.8%）的低溫脫脂豆粕制備SPI，以大豆為原料提取的SPI為對照，考察其在貯藏（37℃）10周過程中溶解度變化及其與初始蛋白的聚集和解離程度的對應關(guān)系。結(jié)果表明：原始SPI（對照）顯示出最高初始溶解度（93%），經(jīng)10周貯藏后其溶解度下降幅度最小。原料變性程度越高，對應SPI初始溶解度越低；而初始溶解度越高，其在貯藏過程中下降越快，10周后三者溶解度幾乎降至同一水平。同時，高變性程度原料制備的SPI聚集或解離程度也越高，不利于SPI短期貯藏中（≤6周）的溶解度；原料變性程度和蛋白初始溶解度均相當時，聚集或解離程度高的SPI在貯藏后期（＞6周）溶解度損失更快。此外，引起蛋白聚集的主要共價鍵是二硫鍵，但除此之外也在變性程度原料的SPI中也發(fā)現(xiàn)其他共價鍵。

脫脂豆粕，大豆分離蛋白（SPI），貯藏，溶解度

不同公司生產(chǎn)的商業(yè)大豆蛋白在結(jié)構(gòu)特征和功能特性存在很大差別，如變性程度、溶解性及表觀粘度等[10]。造成這些差異的原因除了加工工藝上有所不同外，原料的影響也不可排除，如原料豆的品種、豆粕的加工及貯藏史等。黃友如等[11]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱處理后的脫脂豆粕中蛋白多肽鏈會發(fā)生局部展開，同時也生成了大分子聚體。王浩冉[12]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)干熱處理的SPI中含大顆粒的聚集。蛋白原有的結(jié)構(gòu)遭受的破壞會影響其貯藏穩(wěn)定性[13]。而作為SPI的原料，脫脂豆粕在制備SPI前所經(jīng)歷加工貯藏都可能使其中的蛋白遭受破壞，從而會影響到終產(chǎn)品的貯藏穩(wěn)定性。因此，本實驗主要研究不同批次的豆粕制備的SPI貯藏穩(wěn)定性是否有差異，初步探討造成這些差異可能的原因。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大豆（臺灣-292） 無錫雪浪市場種子供應站；低溫脫脂豆粕秦皇島益海嘉里糧油有限公司；PE真空包裝袋上海精品包裝機械有限公司；二羥甲基氨基甲烷（Tris）、過硫氨酸、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）、溴酚藍、考馬斯亮藍R250美國Fisher Scientific公司；5，5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽（DTNB）、三硝基苯磺酸（TNBS）、凝膠色譜分子量標樣、丙烯酰胺及N，N’-甲叉雙烯酰混合凝膠儲液、十二烷基苯硫酸（SDS） 美國Sigma Chemical公司；L-亮氨酸、亞硫酸鈉、甲醇、冰醋酸、過硫酸銨國藥集團化學試劑有限公司。

JZ7114型粉碎機上海朝陽微電機廠；Avanti J-26 XP型高速離心機美國BECKMAN公司；QZ-5型高速離心噴霧干燥機無錫錫山林洲干燥機廠；KDF-103F型半自動微量凱式定氮儀上海纖檢儀器有限公司；Q2000型差示掃描量熱儀（DSC） 美國TA公司；SHP-150型生化培養(yǎng)箱上海森信實驗儀器有限公司；UV-2800H型紫外可見分光光度計尤尼柯（上海）有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀日本島津公司；KW-804型蛋白凝膠柱日本Shodex公司；Mini-PROTEAN 3 Cell凝膠電泳儀美國Bio-Rad公司；BVPJ-500TS型真空包裝機嘉興艾博不銹鋼機械工程有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1SPI的制備及貯藏以采自夏、秋、冬三個不同季節(jié)的商業(yè)低溫脫脂豆粕為原料，參考Liu and Xiong[14]方法進行蛋白提取，得到的蛋白溶液進行噴霧干燥（入口溫度：180℃；出口溫度：80℃），所得的三個樣品分別記為SPI1、SPI2、SPI3。對照為參考Jiang等[15]的方法從大豆中提取的SPI樣品。將得到的蛋白粉用PE袋真空包裝，在37℃恒溫箱中貯藏。所制得SPI經(jīng)凱式定氮（N×6.25確定其純度均大于96.5%（w/w，干基）。

1.2.2變性程度豆粕的變性程度用差式掃描量熱量儀（DSC）進行測定。將豆粕中新鮮提取的大豆分離蛋白分散于純水中（20%，w/v），然后置于專用鋁盤中（14～18mg），以空的鋁盤作為參照進行測定。測定以5℃/min的速度從25℃升溫到120℃。每個樣品重復測定兩次，取平均值進行報道。以從大豆中提取的SPI為對照，各豆粕中蛋白的變性程度表示為：

1.2.3溶解度將固體SPI分散在去離子水中（2%，w/v），室溫下攪拌1h使樣品溶解，靜置2min后，將上層液倒入離心管中離心15min（10000×g）。取上清液10mL，采用凱式定氮測定蛋白濃度。溶解度表示為：

“大學老師介紹了一個幼兒園教師，說我在高校教書，人忠厚老實，蠻有上進心，連續(xù)兩年評了先進，還單槍匹馬供了樓……可惜老師多嘴說了一句，說我詩也寫得好，小有名氣——誰知那個女的就索性不見了，據(jù)老師說，她嚇破了膽。彼時在熱播電視劇《人間四月天》，詩人如徐志摩等都是風流成性的，那我也不保險——”

1.2.4自由氨基參考Lertittikul等[16]的實驗方法，取125μL蛋白溶液，加入2mL的磷酸鹽緩沖液（pH8.2）和1mL 0.01%的TNBS，振蕩混勻后于50℃下避光反應30min，再加入2mL 0.1mol/L的Na2SO3終止反應，冷卻至室溫（15min），測定樣液在420nm處的紫外吸光值。自由氨基含量根據(jù)L-亮氨酸含量的標準曲線來確定。空白為在相同操作下用去離子水代替反應液。

1.2.5分子量分布采用HPLC來研究分子量分布，使用島津高效液相系統(tǒng)和KW-804蛋白凝膠柱和紫外檢測器。柱子的洗脫極限為10，分離柱柱效大于20000。流動相為50mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液，離子強度0.3mol，洗脫速率為1mL/min，洗脫液在280nm處檢測。

1.2.6凝膠電泳參考Liu和Xiong[14]方法對SPI樣品進行SDS-PAGE電泳。采用4%的濃縮膠和12%的分離膠，濃縮膠電流控制在20mA，分離膠控制在40mA。用0.2%的考馬斯亮蘭溶液染色2h，最后用含40%甲醇和10%醋酸的脫色液脫色10h。

1.2.7數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)中的顯著性分析（p＜0.05）采用LSD測試（SPSS Statistical Software，美國），顯著性分析中每個指標中的所有數(shù)據(jù)均為同組分析結(jié)果。

2　結(jié)果與討論

2.1脫脂豆粕的變性程度

原料的變性程度是通過DSC測定豆粕中新鮮提取的SPI變性程度來表征。結(jié)果如圖1所示。對照為以大豆為原料制備的原始SPI。各樣品都顯示兩個熱流峰，以對照為例，峰值分別為77.8℃和96.1℃，對應大豆β-伴球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）。對照中蛋白熱焓值最大，證明其蛋白的結(jié)構(gòu)最接近原始蛋白。SPI1的蛋白熱流峰最小，對應的變性程度為72.6%；SPI2的變性程度為29.4%；SPI3的熱焓值最大，變性程度僅為1.8%。同時，與對照相比，SPI2和SPI3中的變性溫度都升高了約2℃，說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。Lakemond等[17]發(fā)現(xiàn)11S中的酸性多肽鏈的展開很可能與其變性溫度的升高有關(guān)。SPI1、SPI2、SPI3對應的原料分別采自夏、秋、冬三個季節(jié)，所以變性程度的差異很可能是由于不同季節(jié)原料所處的環(huán)境溫度或在加工前經(jīng)歷的貯藏時間不同造成的。

圖1　DSC測定的不同批次的脫脂豆粕中提取的SPI初始熱流圖及變性程度Fig.1　DSC thermograms of initial SPI samples extracted from different batches defatted soy flakes

2.2SPI貯藏過程中溶解度的變化

圖2為不同變性程度的商業(yè)低溫脫脂豆粕制備的SPI在37℃下貯藏10周過程中溶解度的變化情況。變性程度越高的脫脂豆粕所制備的SPI初始溶解度越低，SPI1＜SPI2＜SPI3＜對照。低變性程度原料制備的SPI溶解度雖然高，但在貯藏過程中損失最快，10周后三者幾乎降到同一水平。而對照在貯藏后期（＞6周）溶解度幾乎穩(wěn)定，10周內(nèi)溶解度下降幅度最小。同時發(fā)現(xiàn)，雖然SPI3的原料變性程度和初始溶解度均接近對照，但其溶解度下降速度在貯藏后期（＞6周）遠高于對照。這是因為DSC測定的熱流譜圖即包括蛋白變性的引起的焓變，又包括蛋白聚集的焓變[18]。根據(jù)Lumry-Eyring模型，蛋白的不溶性沉淀產(chǎn)生的過程包括蛋白結(jié)構(gòu)的部分展開，聚集，聚集體的增長，最后變?yōu)椴蝗苄源缶奂w[19]。Chun Liu等[20]的研究也發(fā)現(xiàn)SPI溶解度的下降伴隨著蛋白亞基的降解。Damodaran[21]認為在特定條件下，蛋白質(zhì)溶解度主要是由蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)與水之間相互作用的平衡制約的。因此，除原料的變性程度，很可能還存在其他影響SPI貯藏穩(wěn)定性的因素，如初始蛋白的聚集和解離。

圖2　不同批次的脫脂豆粕中提取的大豆分離蛋白在貯藏過程溶解度的變化Fig.2　The changes in protein solubility of SPI during storage that extracted from different batches defatted soy flakes

2.3初始SPI的解離及聚集程度

2.3.1自由氨基通過測定自由氨基的含量來衡量各SPI的解離程度以L-亮氨酸為基準物測定的自由氨基含量標準曲線如圖3所示，線性擬合方程為y= 0.158x+0.016（R2=0.999）。如圖4所示，SPI1的含量略低于對照，這可能是蛋白聚集使得部分氨基端包埋在分子內(nèi)部造成的。SPI2和SPI3的自由氨基含量都遠高于對照，其中SPI2含量最多，約為對照的2.5倍，這很可能來源于蛋白中多肽鏈發(fā)生解離。

圖3　以亮氨酸為基準物的自由氨基含量標準曲線Fig.3　The standard curve of free amino group content using L-leucine as reference

圖4　不同批次脫脂豆粕中提取的SPI初始的自由氨基含量Fig.4　The free amino groups of initial SPI samples extracted from different batches defatted soy flakes

2.3.2分子量分布凝膠排阻色譜（SEC）測定的蛋白分子量分布也可以揭示蛋白的聚集或解離情況。如圖5所示，峰1為大聚集體（＞1000ku）；峰2是中等聚集體（670～1000ku）；峰3主要是7S和11S（670～43ku）；其他小分子量的峰（＜43ku）為蛋白分解后的肽段，如峰4和峰5。對照中含有微量（＜1%）的中等聚集體（670～1000ku），85%（相對峰面積）以上的蛋白是以7S和11S的形式存在，顯示最低的聚集和解離程度。而高變性原料制備的SPI1中70%以上的蛋白分子都集中在分子量大于1000ku的大聚集體，峰3幾乎消失，剩余部分基本都以小肽鏈形成存在，顯示出最高的聚集程度。中等變性的原料對應的SPI2中除了含有部分中等聚集體外，其小分子肽段（＜43ku）有兩個明顯的高峰（峰4和峰5），含量占到55%以上，而7S和11S對應的峰所占比例非常小，說明該蛋白即有一定的聚集程度，又有較大的解離程度。與前兩樣品相比，低變性原料中提取的SPI3的分子量分布與對照最為接近，含有少量的中等聚集體，7S和11S含量及小分子肽段含量均約為40%，表現(xiàn)出低聚集和解離程度，這一結(jié)果與自由氨基測定結(jié)果相一致。

圖5　不同批次的脫脂豆粕中提取的SPI可溶性部分的分子量分布Fig.5　The molecular weight distribution of SPI extracted from different batches of defatted soy flakes

總之，高變性程度的豆粕對應的SPI中高的聚集或解離程度，從而不利于蛋白的溶解度。而當原料的變性程度相當，高聚集或解離程度的SPI在長期貯藏過程中（＞6周）溶解度下降越快。

2.4初始SPI的電泳分析

為揭示蛋白亞基組成以及共價性聚集情況，實驗對SPI的可溶性部分進行非還原和還原電泳。圖6（a）為SPI非還原電泳結(jié)果，濃縮膠頂部及分離膠中大于97ku的條帶區(qū)間為共價聚集體，各樣品均含有明顯的聚集體條帶，其中對照組含量最少，高變性原料制備的SPI1中的聚集體含量最多，其次SPI3和SPI2。此外，對比各蛋白的亞基組成，可以看出對照組中A和B亞基條帶最少，而其他三組樣品的這兩個亞基條帶非常明顯，驗證了對照組解離程度最小。在還原條件下，如圖6（b）所示，對照、SPI2和SPI3中的聚集體幾乎完全消失，SPI1中聚集體的也大大減少了。這一結(jié)果說明SPI共價聚集體幾乎都是通過二硫鍵結(jié)合的。而高變性程度原料制備的SPI1經(jīng)還原后還殘留一小部分聚集體，說明還有其他非二硫鍵的共價鍵參與蛋白聚集。

圖6　不同批次脫脂豆粕中提取的大豆分離蛋白（SPI）可溶性部分的SDS-PAGE電泳圖Fig.6　The SDS-PAGE profiles of soluble parte of soy protein isolate（SPI）that extracted from different batches of defatted soy flakes

3　結(jié)論

不同變性程度的脫脂豆粕可能在制備SPI前經(jīng)歷的加工儲藏史有所不同，導致最終所提取的SPI貯藏穩(wěn)定性的差異，如溶解度的損失情況。這一差異除了與原料變性程度有關(guān)外，還與豆粕中蛋白的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。原料變性程度越高，所制備的SPI聚集或解離程度越高，在短期貯藏時間內(nèi)（≤6周）溶解度越差，如夏季的脫脂豆粕中提取的SPI。原料變性程度相似，所制備的SPI初始溶解度也相當?shù)那闆r下，高的聚集或解離度很可能會加速其溶解度在貯藏過程的下降。

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Effect of the denaturation degree of defatted soy flakes on structural properties and storage stability of produced protein isolate

GUO Feng-xian1，HE Zhi-yong1，HUANG Xiao-lin1，XIONG You-ling1，CHEN Jie1，2，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，and School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The objective of this study was to reveal the influence of different denatured material on the storage stability of soy protein isolate（SPI），as well as its relationship with the structural properties.SPI that prepared from soybeans was considered to be the control.Three SPI samples were extracted from defatted soy flakes（with denaturation degrees of 72.6%，29.4%，1.8%，separately）and stored（37℃）for 10 weeks.The storage stability was evaluated by tracking protein solubility during storage and the initial structural properties were then determined.Results showed that，the control exhibited the highest protein solubility（93%）at the initial state of storage，and the least decline after 10-wk storage.The highest denaturation degrees of the defatted flakes，the lowest initial solubility was found in the resulted SPI，SPI with higher initial solubility showed faster decline rate during storage，reduced to the same level after 10 weeks.Furthermore，SPI that extracted from high-denatured material displayed high aggregation or dissociation degree，which was harmful to the protein solubility of short-time（≤6wk）stored sample.When the samples shared similar denaturation degree and the initial solubility，SPI with higher level of aggregation or dissociation exhibited higher rate of solubility decline after long-time（＞6wk）storage.In addition，disulfide linkage was the main covalent bond mediated in protein aggregation，and some other covalent bond was also found in high denatured sample.

defatted soy flake；soy protein isolate（SPI）；storage；protein solubility

TS251.1

A

1002-0306（2015）04-0097-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.012

2014－05－23

郭鳳仙（1984-），女，在讀博士研究生，研究方向：食品蛋白質(zhì)功能。

陳潔（1969-），女，博士，教授，研究方向：食品蛋白質(zhì)功能，食品安全監(jiān)測。

國家自然科學基金（31271946）；高等學校博士學科點專項科研基金資助課題（20100093120005）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃（1026010241111090）。