熱-超聲波聯合對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果研究

施紅英，張靜巖，吳衛東，陳　晨，廖紅梅，丁占生

（江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

熱-超聲波聯合對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果研究

施紅英，張靜巖，吳衛東，陳晨，廖紅梅*，丁占生

（江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

研究了32～52℃條件下，熱處理以及熱-超聲波聯合處理對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果，分析了溫度對熱-超聲波聯合殺菌效果的影響。結果表明：32～52℃熱處理殺菌效果遠遠達不到衛生標準；而熱-超聲波聯合作用殺菌效果顯著增強，在52℃下，190、380、570W分別處理40、30min和30min即可達到平板菌落計數法檢測限；在熱-超聲波聯合處理中，較低溫度（32～47℃）對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果貢獻較小，殺菌效果主要取決于超聲波作用；而致死溫度（52℃）體現協同殺菌效應，增強殺菌效果，提高殺菌速率。

鼠傷寒沙門氏菌，熱-超聲波聯合，殺菌，溫度

超聲波技術在食品工業中已經得到廣泛應用，例如殺菌、清洗、滅酶、均質、結晶化、消泡、脫氣以及提取酚類化合物、精油等[1]。在殺菌方面，超聲波可作為一種有效的輔助殺菌方法，廣泛應用于液態食品如果汁（包括橙汁、胡蘿卜汁、蘋果汁）、啤酒、牛奶和液蛋[2-3]；少量應用于固態食品清洗消毒，包括萵苣、番茄和草莓[4-6]；同時該方法也成功用于廢水處理、飲用水消毒[7]。

超聲波殺菌主要歸因于超聲過程中由于空化泡破裂產生瞬間高溫、高壓、剪切力以及自由基的聲化學效應[8]。單獨采用超聲波殺菌效果有限，通?？紤]結合其他技術聯合殺菌。熱-超聲波聯合殺菌已被證實具有較好的殺菌效果。例如Salleh-Mack和Roberts報道采用低溫條件下（30°C）超聲波處理大腸桿菌（E.coli ATCC 25922）9～11min可以使其降低4～5.4個對數，而升高溫度（60°C）僅處理3min即可達到降低5個對數[9]。Ordonez[10]、方祥等[11]也報道熱-超聲波聯合處理比單獨采用相同溫度熱處理的的殺菌效果更好，目前未見有報到分析熱-超聲波聯合處理對殺菌效果的影響。

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）是一種食品中常見致病菌，在肉、奶、蛋及其制品中比較常見，在果蔬及其制品中也容易感染從而引發腹瀉等不良癥狀。本文主要研究熱-聯合超聲波對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果，分析溫度對熱-聯合超聲波殺菌的影響，為該技術的應用提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鼠傷寒沙門氏菌購自中國普通微生物菌種保藏中心（China Microbiological Culture Collection Center，CMCC），編號為CMCC 50115；牛肉膏、蛋白胨、酵母抽提物、葡萄糖、氯化鈉、瓊脂粉均購自北京奧博星生物科技有限公司；牛肉膏蛋白胨酵母抽提物固體培養基（beef peptone yeast broth，BPY）配方牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，氯化鈉5.0g/L，瓊脂粉15.0g/L，調pH7.0。

Scientz-IID型超聲波細胞破碎儀寧波新芝生物技術有限公司；DC0506型低溫恒溫槽上海衡平儀器儀表廠；SW-CJ-2FD型無菌操作臺蘇州凈化設備技術有限公司；ZDX-35BI型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠；SPX型智能生化培養箱南京實驗儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1微生物培養根據CMCC指導書將鼠傷寒沙門氏菌的凍干菌粉經過BPY液體培養基活化兩次以后活力得到復壯，并接種在BPY斜面培養基上2℃保藏。用接種環接種3環到100mL培養基中，37℃下培養。采用比濁法測定鼠傷寒沙門氏菌的生長曲線，確定其達到穩定生長初期所需時間為10h，以得到菌活力較強且穩定的菌液。培養好的菌液用BPY培養基稀釋到107CFU/mL，作為后續實驗的菌液樣品。

1.2.2熱-超聲波聯合處理將與低溫恒溫槽連接的夾套燒杯用75%酒精浸泡30min，然后用無菌去離子水沖洗3遍，再用菌液潤洗1次，加入60mL菌液，開啟水浴循環使菌液預熱到設定溫度，啟動超聲波（超聲頻率為20～25kHz），在不同溫度、功率下進行熱-超聲波聯合處理40min，每間隔5min取樣，迅速于4℃下冷卻，并立即測定殘存菌數。同時做熱處理對照，即在不開啟超聲波的條件下，采用與熱-超聲波處理一致的溫度、時間、加樣量條件處理菌液，并取樣以測定殘存菌數。

1.2.3微生物數量測定采用平板計數法測定微生物數目。將菌液用0.85%生理鹽水以10倍稀釋法進行逐級稀釋，根據細菌數量選擇合適的稀釋度進行逐級稀釋，吸取連續3個不同稀釋度的稀釋樣1.0mL于滅菌平皿中，倒入約15mL BPY瓊脂培養基，搖勻后在（37±0.1）℃條件下培養24h。并記錄菌落數。殺菌效果采用殘活率對數值（logN/N0）表示，其中：N0為處理前的初始微生物數量（CFU/mL）；N為處理后的微生物數量（CFU/mL）。

1.2.4數據統計分析所有實驗均重復3次，數據采用方差分析（ANOVA）。數據采用Origin 7.5進行統計并繪圖。

2　結果與分析

2.1熱處理對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果分析

如圖1所示，32～42℃熱處理40min后，BPY培養基中鼠傷寒沙門氏菌均存在一定程度增殖現象，最高達到增加0.7個對數；47℃熱處理后，鼠傷寒沙門氏菌的殘存數量基本保持不變（p＞0.05）；52℃熱處理15min之內，鼠傷寒沙門氏菌數量有所降低，但變化不顯著（p＞0.05），而處理20～40min后，其殘存菌數顯著下降（p＜0.05）。在52℃熱處理40min之后，鼠傷寒沙門氏菌數量降低1.2個對數。表明單獨采用熱處理鼠傷寒沙門氏菌，其熱致死溫度大于47℃，且處理時間較長。

圖1　32～52℃下熱處理對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果Fig.1　Effect of mild heat on inactivation of Salmonella typhimurium at 32～52℃

2.2熱-超聲波聯合對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果分析

如圖2所示，為熱-超聲波聯合處理在190W、32～52℃條件下對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果。在32～52℃條件下，經過熱-超聲波聯合處理后鼠傷寒沙門氏菌殘存菌數呈現不同程度降低，較相同溫度熱處理（圖1）其殺菌效果顯著增強（p＜0.05）；且殺菌效果隨著處理時間延長而增強，在52℃條件處理40min達到完全滅菌，微生物數量降低了7.88個對數；在32～47℃，殺菌效果隨溫度升高有所增強，但并未顯著增強（p＞0.05）經過各溫度的熱-超聲波聯合處理40min后，鼠傷寒沙門氏菌降低了2.93～3.67個對數；而當溫度進一步升高到52℃，殺菌效果顯著增強（p＜0.05）；殺菌曲線呈現線性趨勢。

如圖3所示，為熱-超聲波聯合處理在380W、32～52℃條件下對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果。由圖3可以得出，在各溫度條件下，殺菌效果隨著處理時間延長而增強；當溫度由32℃升高到37～47℃，殺菌效果顯著增強（p＜0.05）；溫度在37～47℃之間，殺菌效果無顯著變化（p＞0.05），處理40min后鼠傷寒沙門氏菌降低了4.29～4.58個對數；當溫度進一步升高到52℃，殺菌效果劇烈而顯著增強，在380W下，處理15min即達到降低6個對數，處理30min即達到完全滅菌。另外，在較低溫度條件下（32～47℃），殺菌曲線呈線性趨勢，而在較高溫度下（52℃），呈現5min殺菌緩慢、5～20min快速殺菌、20～40min趨于平緩及至完全滅菌的三段式趨勢。由此可見，在380W條件下，溫度為37～47℃對殺菌效果影響不大，而當溫度進一步升高到52℃，則在較高溫度下改變了鼠傷寒沙門氏菌的殺菌模式。

圖3　在380W條件下低溫輔助超聲波（32～52℃）對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果Fig.3　Effect of thermosonication on inactivation of Salmonella typhimurium at 380W and 32～52℃

如圖4所示，為熱-超聲波聯合處理在570W、32～52℃條件下對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果。由圖4可以得出，在各溫度條件下，殺菌效果隨著處理時間延長而增強。在32～52℃范圍內，殺菌效果變化趨勢與380W條件下類似，即從32℃升高到37～47℃，殺菌效果顯著增強（p＜0.05）；而37～47℃之間沒有顯著變化（p＞0.05）；再次升高到52℃后殺菌效果劇烈而顯著增強（p＜0.05）。各溫度條件下，殺菌曲線趨勢也與380W條件下類似，即32～47℃呈現線性下降、52℃呈現慢-快-慢的三段式殺菌趨勢。在37～47℃條件下處理40min，鼠傷寒沙門氏菌降低了4.35～4.72個對數，在52℃條件處理20min，使鼠傷寒沙門氏菌降低了7個對數以上。

圖4　在570W條件下低溫輔助超聲波（32～52℃）對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果Fig.4　Effect of thermosonication on inactivation of Salmonella typhimurium at 570W and 32～52℃

由圖2～圖4可以得出，在32℃條件下，殺菌效果并未隨功率增強而增強。當溫度在37～47℃范圍，在190W條件下，隨著溫度升高，殺菌效果有所增強，但變化并不顯著（p＞0.05），在380～570W條件下，溫度對殺菌效果幾乎沒有影響，殺菌曲線大多聚集在一起。在52℃下，當功率由190W增強為380W，殺菌效果顯著增強，殺菌速率增大；當功率進一步增強為570W時，殺菌效果變化并不顯著，即功率對其影響不大。

3　討論

在32～42℃條件下，熱處理對鼠傷寒沙門氏菌具有增殖影響；在52℃條件下殘存鼠傷寒沙門氏菌數量才有明顯降低。在對應相同溫度下，熱-超聲波聯合處理殺菌效果具有顯著優勢（圖1～圖4）。說明在熱-超聲波聯合處理中熱和超聲波具有協同殺菌效應。但在32～47℃條件下，熱效應對聯合殺菌的影響較小，超聲波的作用占主導地位。在52℃條件下，二者的協同效應顯著增強。熱處理協同促進超聲波殺菌效果增強的現象在研究大腸桿菌殺菌時已被證實[9，12]。Salleh-Mack和Roberts報道在30℃條件下使大腸桿菌ATCC 25922降低4～5.4個對數需要9～11min，而結合熱處理在60℃條件下僅需處理3min就可達到降低5個對數以上[9]。說明熱-超聲波聯合殺菌在食品加工過程中具有巨大潛力。

溫度對熱-超聲波聯合處理殺菌效果影響比較復雜。由圖1可知，在營養豐富的BPY培養基中，32～42℃是鼠傷寒沙門氏菌的增殖溫度，47℃為其亞致死溫度，52℃為其致死溫度。進而由圖2～圖4可知，在聯合超聲波處理的情況下，亞致死及增殖溫度（32～47℃）對熱-超聲波聯合處理鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果貢獻不大，殺菌效果主要取決于超聲波作用；而致死溫度（52℃）體現協同殺菌效應，增大殺菌速率。Ugarte-Romero等[13]曾報道超聲波增強致死溫度（50℃）對李斯特氏菌的殺菌效果。這主要是由于中等強度溫度的熱處理會破壞革蘭氏陰性細菌外層的細胞外膜，從而有利于超聲波作用[14]。

4　結論

由實驗可知，32～52℃熱處理殺菌效果很不理想，而熱-超聲波聯合作用殺菌效果顯著增強。在52℃條件下，190、380和570W分別處理40、30和30min即可達到平板菌落計數法檢測限。在熱-超聲波聯合處理中，增殖及亞致死溫度（32～47℃）對熱-超聲波聯合處理鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果貢獻不大，殺菌效果主要取決于超聲波作用；而致死溫度（52℃）體現協同殺菌效應，增大殺菌速率。

[1]Chemat F，Zill-e-Huma，Khan M K.Applications of ultrasound in food technology：Processing，preservation and extraction[J]. Ultrasonics Sonochemistry，2011，18：813-835.

[2]栗星，包海蓉.超聲波對橙汁的殺菌特性研究[J].食品科學，2008，29（8）：346-349.

[3]Arroyo C，Cebrián G，Pagán R，et al.Inactivation of Cronobacter sakazakii by ultrasonic waves under pressure in buffer and foods [J].International Journal of Food Microbiology，2011，144：446-454.

[4]Cao S，Hu Z，Pang B，et al.Effect of ultrasound treatment on fruit decay and quality maintenance in strawberry after harvest [J].Food Control，2010，21（4）：529-532.

[5]S?o José J F B，Vanetti M C D.Effect of ultrasound and commercial sanitizers in removing natural contaminants and Salmonella enterica Typhimurium on cherry tomatoes[J].Food Control，2012，24：95-99.

[6]Sagong H G，Lee S Y，Chang P S，et al.Combined effect of ultrasound and organic acids to reduce Escherichia coli O157∶H7，Salmonella typhimurium and Listeria monocytogenes on organic fresh lettuce[J].International Journal of Food Microbiology，2011，145（1）：287-292.

[7]Bott T R，Liu T Q.Ultrasound enhancement of biocide efficiency[J].Ultrasonic Sonochemistry，2004，5（11）：323-326.

[8]McClements D J.Advances in the application of ultrasound in food analysis and processing[J].Trends in Food Science and Technology，1995，6：293-299.

[9]Salleh-Mack S Z，Roberts J S.Ultrasound pasteurization：the effects of temperature，soluble solids，organic acids and pH on the inactivation of Escherichia coli ATCC 25922[J].Ultrasonics Sonochemistry，2007，14：323-329.

[10]Ordonez J A，Sanz B，Hernandez P E.A note on the effect of combined ultrasonic and heat treatments on the survival of thermoduric streptococci[J].Journal of Applied Bacteriology，1984，54：175-177.

[11]方祥，唐煥武.超聲波對幾種常見腸道致病菌殺滅效果及其作用機理探討[J].聲學技術，2009，28（4）：491-494.

[12]Ugarte-Romero E，Feng H，Martin S E，et al.Inactivation of Escherichia coli with power ultrasound in apple cider[J].Journal of Food Science，2006，71（2）：E102-E108.

[13]Ugarte-Romero E，Feng H，Martin S E.Inactivation of Shigella boydii 18 IDPH and Listeria monocytogenes Scott A with power ultrasound at different acoustic energy densities and temperatures[J].Journal of Food Science，2007，72（4）：M103-107.

[14]Condón S，Raso J，Pagán R.Microbial inactivation by ultrasound[M].In：Barbosa-Canovas，G V，Tapia，M S，Cano，M P.（Eds.），Novel food processing techniques，Boca Raton，FL：CRC Press LLC，2005：423-442.

Study on effect of temperature on inactivation of Salmonella typhimurium by thermosonication

SHI Hong-ying，ZHANG Jing-yan，WU Wei-dong，CHEN Chen，LIAO Hong-mei*，DING Zhan-sheng
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Inactivation of Salmonella typhimurium by mild heat and thermosonication at 32～52℃，especially the effect of temperature on inactivation were investigated.Results showed that it did not meet safety standards as suspension exposed to mild heat at 32～52℃，while the log-reduction of S.typhimurium was significantly enhanced by thermosonication at the same temperature.The inactivation of S.typhimurium reaching the level of non-detectable limit were achieved when suspension were under 190W for 40min and under 380，570W for 30min at 52℃，respectively.Mild heat exerted minimal inactivation effects on S.typhimurium during thermosonication treatment at lower temperature（32～47℃），and ultrasound was dominant.At lethal temperature of 52℃，the synergistic effects of ultrasound and mild heat existed，which enhanced inactivation efficacy and rates.

Salmonella typhimurium；thermosonication；inactivation；temperature

TS255.44

A

1002-0306（2015）04-0089-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.010

2014－05－23

施紅英（1991-），女，本科，主要從事食品非熱加工技術方面的研究。

廖紅梅（1983-），女，博士，講師，主要從事食品非熱加工技術方面的研究。

國家自然科學基金項目（31101360）；中央高?；究蒲袠I務費專項資金資助（JUSRP21125）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目。