石墨烯作為新型固相萃取填料結合UPLC-MS/MS測定黑魚中13種磺胺類藥殘

鄭婷璐，戴志遠，方旭波，陳小娥

（1.浙江海洋學院食品與醫藥學院，浙江舟山316022；2.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310035）

石墨烯作為新型固相萃取填料結合UPLC-MS/MS測定黑魚中13種磺胺類藥殘

鄭婷璐1，戴志遠2，方旭波1，陳小娥1

（1.浙江海洋學院食品與醫藥學院，浙江舟山316022；2.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310035）

建立了以石墨烯為固相萃取填料，結合高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜聯用技術測定黑魚中磺胺類獸藥殘留的檢測方法。采用甲醇作為提取溶劑，經石墨烯固相萃取柱凈化富集，質譜采用電噴霧正離子源，多反應監測模式。方法的線性良好，相關系數大于0.998，檢出限范圍0.048～0.288μg/kg，定量限為0.160～0.960μg/kg，線性范圍內的加標回收率為70.6%～93.8%。本方法靈敏、可靠、穩定，滿足復雜水產品基質中磺胺類藥殘檢測的需要。

石墨烯，黑魚，磺胺類藥殘，固相萃取，液相色譜-質譜聯用

磺胺類藥物是具有對氨基苯磺酰胺結構的一類藥物的總稱，它具有效價高、抗菌譜廣、性質穩定等優點。但是由于不合理的使用會容易引起其耐藥菌的增加，而且動物性食品中殘留的磺胺也會對人體健康造成潛在危害。為了保證食品安全，歐盟對食品中的磺胺類獸藥制定了最高允許量，單個磺胺類藥物的濃度不得超過25μg/kg，磺胺類獸藥總量不得超過100μg/kg[1]。因此，建立一種快速有效的磺胺檢測方法非常重要。

在殘留分析中，固相萃取由于其回收高、萃取時間短、溶劑用量少等特點成為一種有著廣泛應用前景的前處理技術。然而，常用的固相萃取吸附劑，如C18、硅膠等往往只適用于數量有限的樣品。因此，開發一種新型的固相萃取吸附劑具有較高價值。

石墨烯是近年來發現的一種二維碳原子晶體[2-3]，是已知最薄的材料之一。研究發現石墨烯在機械性能、導電能力、熱力學等性質上均能表現出良好的應用前景[4-6]。除此之外，石墨烯具有巨大的比表面積和二維平面結構[7]，為吸附提供了可能，因此石墨烯作為一種吸附劑成為近幾年的研究熱點。其中已經有研究成功利用石墨烯作為分散劑[8]、固相微萃取填料[9-10]和固相萃取填料[11-13]對各類目標化合物進行吸附萃取，表明石墨烯可以作為一種吸附性良好的萃取劑對樣品進行前處理。

目前，國內外關于液相色譜法或液質聯用技術檢測磺胺殘留的報道文獻很多，比如國內有研究采用固相微萃取劑[14]、液相微萃取[15]、基質固相分散[16-17]等測定磺胺類藥殘；國外有研究利用商業化的HLB固相萃取小柱對多種樣品凈化富集后測定磺胺類藥殘[18]，但是由于磺胺類藥物種類較多，前處理時間長，有機試劑使用量大而且成本高（商業固相萃取柱多為一次性），而且以石墨烯作為固相萃取填料檢測水產品中磺胺的研究報道很少。本實驗是在此基礎上研究建立一種以石墨烯為固相萃取填料同時檢測水產品中多種磺胺類藥殘的方法，以期為生產實踐提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黑魚購于杭州物美超市；甲醇、乙腈和甲酸色譜級，德國Merck公司；13種磺胺類標準品購自Sigma-Aldrich公司，純度≥99%，分別為磺胺氯達嗪 （Sulfachloropyridazine，SCP）、磺胺甲惡唑（Sulfamethoxazole，SMX）、磺胺甲嘧啶（Sulfamerazine，SMR）、磺胺異惡唑（Sulfisoxazole，SIZ）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，SMZ）、磺胺對甲氧嘧啶（Sulfameter，SME）、磺胺多辛（Sulfadoxin，SDX）、磺胺喹惡啉（Sulfaquinoxaline，SQX）、磺胺噻唑（Sulfathiazole，STZ）、磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺二甲氧噠嗪（Sulfadimethoxin，SDM）和 磺 胺 甲 氧 噠 嗪（Sulfamethoxypyridazine，SMP）；石墨純度≥98%，Fisher Scientific公司；3mL固相萃取柱上海安譜公司。

S-4700型掃描電鏡日本日立公司；高速冷凍離心機德國Thermo公司；Milli-Q超純水凈化系統美國Millipore公司；固相萃取儀美國Supelco公司；Acquity UPLC液相色譜美國Waters公司；4000QTrap三重四級桿質譜儀美國應用生物系統公司。

1.2實驗方法

1.2.1石墨烯的制備采用Hummers方法[19]制備氧化石墨烯（GO），然后將100mg氧化石墨烯分散于100mL水溶液中，超聲1h后移入燒瓶中，加入2mL水合肼于95℃水浴中冷凝回流24h[20]，抽濾得到的黑色粉末分別用甲醇和水清洗多次，最后冷凍干燥得到石墨烯保存備用。

1.2.2樣品提取與固相萃取取（2.00±0.05）g樣品于50mL離心管中，加入10mL甲醇后超聲提取10min，12000r/min下離心10min，將上清液轉移至梨形瓶中，于45℃旋轉蒸發至干[21]。加1mL甲醇-超純水（v/v 2/3）溶解，將溶液轉移至2mL離心管中，加入1mL正己烷，渦旋振蕩2min，12000r/min下離心10min，去除上層正己烷層，取下清液過固相萃取柱。固相萃取采用自制的石墨烯填料固相萃取柱（15mg，3mL），使用前用甲醇活化。樣品溶液以1～2mL/min的速度過固相萃取柱，用1mL 5%甲醇水溶液淋洗，減壓抽干后用適當的有機試劑洗脫磺胺類化合物，洗脫液在45℃下旋轉蒸發至干。最后用1mL初始流動相溶解，0.22μm濾膜過濾以供進樣。

1.2.3標準曲線磺胺標準儲備液（100μg/mL）保存于4℃條件下，再依次用黑魚空白樣品基質提取液（按照1.2.2處理）稀釋成1、5、10、25、50、100μg/kg濃度的標準溶液。平行3次測定，以標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4回收率與精密度實驗加標回收率采用三個濃度添加水平下（分別為10、25、50μg/kg）測得，日內精密度重復實驗六次測定得到，日間精密度連續六天重復進樣測得。

1.3液質條件

1.3.1液相條件采用Acquity UPLC BEH C8柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；流動相：A為0.1%甲酸，B為乙腈。梯度洗脫程序如表1所示，流速為0.4mL/min，進樣體積為2μL。

表1　磺胺類化合物液相色譜梯度洗脫程序Table.1　Gradient elution program of thirteen SAs

1.3.2質譜條件以100ng/mL磺胺標準溶液針泵進樣，在全掃描模式（Full-Scan）下確定被測化合物的母離子，然后通過子離子掃描模式（Product Ion-Scan）下確定兩對定性與定量的子離子，并且對離子源參數以及去簇電壓、碰撞電壓和碰撞室出入口電壓等質譜參數進行了優化。最終確定質譜條件：ESI+離子源；多反應監測模式（MRM）；離子源溫度500℃；噴霧電壓4500V；氣簾氣241kPa；霧化氣241kPa；加熱氣414kPa，13種磺胺類化合物定量以及輔助定性離子對參數見表2。

1.4數據處理

數據采集與處理通過儀器配套的Analyst 1.5.1軟件進行分析。

2　結果與分析

2.1石墨烯的表征-掃描電鏡分析

石墨烯采用Hummers方法制備，通過水合肼還原后的石墨烯得率較高（達到70%以上）。圖1為石墨烯的掃描電鏡圖。從圖1中可以看出，在放大50000倍數下，實驗合成的石墨烯非常薄，表面較平整，具有較大的比表面積，為吸附提供了可能性。但是從圖中發現仍然存在不少褶皺和重疊之處，這可能是在合成過程中部分石墨烯發生團聚造成。

表2　優化后的質譜參數Table.2　Optimized MS/MS parameters

圖1　石墨烯掃描電鏡圖（50000×）Fig.1　The SEM image of graphene（50000×）

2.2固相萃取條件的優化

通過實驗發現，13種磺胺類化合物的回收率變化趨勢基本一致，所以本實驗以磺胺氯噠嗪、磺胺對甲氧噠嗪和磺胺甲氧噠嗪的回收率為例（下同）進行分析討論。

2.2.1洗脫溶劑的選擇洗脫液的選擇直接關系到樣品最終的回收率，由圖2可知，相較于其他洗脫溶劑，丙酮的洗脫能力更勝一籌，但是仍未達到理想的回收效果，經多次實驗發現，在丙酮中添加少量氨水具有更好的洗脫效果，這可能是因為磺胺類化合物在堿性條件下，仲氨基N的H+解離能力增加[22]，添加氨水后呈堿性更容易被洗脫下來。因此，本實驗采用含氨的丙酮作為洗脫溶劑。

圖2　洗脫溶劑對磺胺回收率的影響Fig.2　The effect of the eluent type on the recovery of SAs

2.2.2洗脫體積的選擇在選擇相同洗脫溶液的條件下，由于磺胺類化合物在石墨烯填料上的吸附能力不同，因此所需的洗脫液洗脫體積不同，洗脫體積過少導致化合物不能完全被洗脫下來，體積過多不僅浪費試劑，且可能將一些強保留的化合物洗脫下來[23]。由圖3可知，隨著洗脫體積的增加，磺胺類化合物的回收率也隨之增加，當洗脫液體積達到3mL以后對磺胺化合物的回收率變化不明顯，表明此時大部分磺胺類化合物已經被完全洗脫下來。因此，本實驗選擇使用3mL作為最佳洗脫液體積。

圖3　洗脫體積對磺胺回收率的影響Fig.3　The effect of the eluent volumn on the recovery of SAs

2.2.3石墨烯填料質量的選擇在進行固相萃取的過程中，使用不同質量的石墨烯填料對于目標化合物的回收率有比較大的影響。往往填料太多會造成吸附力過強而不容易洗脫，太少則會使目標物在上樣過程中直接損失。由圖4可知，當石墨烯的質量達到15mg時，能達到比較理想的回收效果，而當質量增加至15mg以后對磺胺類化合物的回收率變化影響不大。因此，本實驗選擇15mg的石墨烯作為最佳填充質量。

圖4　石墨烯質量對磺胺回收率的影響Fig.4　The effect of the amount of graphene on the recovery of SAs

2.3液質條件的優化

在13種磺胺類化合物中，磺胺多辛（SDX）和磺胺二甲氧噠嗪（SDM）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）和磺胺甲氧噠嗪（SMP）具有相同的分子量，分別為311和281，通過二級質譜能得到不同的離子對，從而將不同的目標化合物分離，每個目標化合物選取2對離子對，其中響應較強的為定量離子對，響應較弱的為定性離子對。在選擇電壓時，如果電壓太小則不能產生有效子離子，若電壓過大則會造成碎片離子過多而找不到目標子離子[1]，因此對質譜電壓等條件進行優化非常有必要。優化后磺胺類化合物的質譜采集電壓等參數見表2，其中優化后液質的多反應監測圖見圖5，如圖所示，磺胺類化合物的的峰型和分離度都較好，基質干擾較小，分離時間僅需12min，其中磺胺二甲氧嘧啶離子對（SDM）的響應最強，磺胺氯噠嗪離子對（SCP）的響應相對最弱。

圖5　磺胺標準液的多離子反應監測圖Fig.5　MRM chromatograms for the standards of SAs

2.4與其他填料比較

為了探究石墨烯的吸附性能，本實驗比較了石墨烯與C18、多壁碳納米管等其他常用填料對磺胺類化合物的吸附性（均在各自優化條件下）。由圖6可知，石墨烯對磺胺類化合物的回收率最高（達到90%以上），C18次之（在80%～85%之間），而多壁碳納米管的回收率最低（在75%～80%之間），說明相較于其他兩種填料，石墨烯具有更強的吸附能力，同時所消耗的填料質量與洗脫劑用量相較于其他兩種填料也是最少的。

圖6　石墨烯與其他填料的萃取效果比較Fig.6　Comparison of graphene-based SPE with other sorbents

表3　磺胺類化合物的線性方程、范圍及檢出限和定量限Table.3　Linear equation，LOD and LOQ of SAs

2.5方法學驗證

2.5.1線性方程、相關系數、檢出限和定量限磺胺類化合物的線性方程及相關系數見表3，線性方程的相關系數R2均在0.998以上，線性范圍1～100μg/kg，13種磺胺類化合物的方法檢出限為0.048～0.288μg/kg，定量限為0.160～0.960μg/kg，可以滿足供試樣品定量分析的需要。

表4　磺胺類化合物三種濃度添加水平下回收率、日內和日間精密度Table.4　The recovery，precision of intra-day and inter-day of SAs in three concentrations

2.5.2加標回收率與精密度由表4可以看出，13種磺胺類化合物的回收率和精密度較好，回收率在70.6%～93.8%之間，日內精密度和日間精密度分別不超過4.6%和6.7%，能夠滿足方法的要求。

2.6樣品檢測

采用1.2.2前處理方法，對從超市購買的十批次黑魚進行了檢測，檢測結果反映了水產養殖業對磺胺類藥物的使用狀況。在部分批次黑魚樣品中同時檢出磺胺甲嘧啶（≤0.12μg/kg）、磺胺嘧啶（≤0.15μg/kg）和磺胺二甲嘧啶（≤0.28μg/kg），但是含量檢出濃度小于定量限。這些藥物可能是由人類代謝物進入生態循環系統引起，也可能是養殖戶在養殖過程中投放使用導致。

3　結論

建立了以石墨烯為新型固相萃取填料，同時測定水產品中13種磺胺的超高效液相色譜-串聯質譜的分析方法。水產品通過石墨烯固相萃取柱的凈化富集后，采用液質聯用方法進行分析，方法的線性良好，回收率較高，精密度以及檢出限、定量限均能達到方法檢測需要，與其他填料相比，采用石墨烯作為固相萃取填料對磺胺類藥殘進行吸附凈化具有更高的回收率，更少的溶劑用量，更小的基質干擾（檢出限較低），適用于在復雜水產品基質中的磺胺類藥物殘留的檢測分析。

[1]吳西梅，楊業，楊春穗，等.高效液相色譜質譜測定肉品中的磺胺二甲嘧啶[J].中國衛生檢驗雜志，2004，14（2）：164-165.

[2]楊全紅，呂偉，楊永崗，等.自由態二維碳原子晶體——單層石墨烯[J].新型炭材料，2008，23（3）：97-103.

[3]楊全紅.“夢想照進現實”——從富勒烯、碳納米管到石墨烯[J].新型炭材料，2011，26（1）：1-4.

[4]王麗，潘云濤.石墨烯的研究前沿及中國發展態勢分析[J].新型炭材料，2010，25（6）：401-408.

[5]陳操，翟文濤，鄭文革.水溶性石墨烯及其高導電率薄膜的制備與表征[J].無機材料學報，2011，26（7）：707-710.

[6]Novoselov K S，Geim A K，Morozov S V，et al.Two-Dimensional Gas of Massless Dirac Fermions in Graphene[J]. Nature，2005，438：197-200.

[7]Yang W，Ratinac K R，Ringer S P，et al.Carbon nanomaterials in biosensors：should you use nanotubes or graphene?[J].Angew Chem Int Ed，2010，49：2114-2138.

[8]Luo Y B，Shi Z G，Gao Q，et al.Magnetic retrieval of graphene：Extraction of sulfonamide antibiotics from environmental water samples[J].J Chromatogr A，2011，1218：1353-1358.

[9]Zhang S L，Du Z，Li G K.Layer-by-Layer Fabrication of chemical-bonded graphene coating for solid-phase microextraction [J].Anal Chem，2011，83：7531-7541.

[10]李偉，賈其娜，趙廣超.石墨烯復合材料固相微萃取涂層的制備及其對水樣中六六六殘留的測定[J].分析測試學報，2011，30（7）：734-738.

[11]Liu Q，Shi J B，Zeng L X，et al.Evaluation of graphene as an advantageous adsorbent for solid-phase extraction with chlorophenols as model analytes[J].J Chromatog A，2011，1218：197-204.

[12]Wu J B，Qian Y S，Zhang C L，et al.Application of graphene-based solid-phase extraction coupled with ultra highperformance liquid Chromatography-tandem mass spectrometry for determination of macrolides in fish tissues[J].Food Anal Methods，2013（6）：1448-1457.

[13]Chen L Y，Lu Y B，Li S Y，et al.Application of graphenebased solid-phase extraction for ultra-fast determination of malachite green and its metabolite in fish tissues[J].Food Chem，2013，141（2）：1383.

[14]彭英，何歡，孫成，等.新型固相微萃取-高效液相色譜測定牛奶中4種磺胺類藥物殘留[J].分析化學，2013，41（4）：529-533.

[15]林珊珊，岳振峰，張毅，等.微波輔助中空纖維液相微萃取-液相色譜-串聯質譜法同時快速測定牛奶中27種抗生素殘留[J].分析化學，2013，41（10）：1511-1517.

[16]王重洋，王遠鵬，王寧，等.基質固相分散-超快速液相色譜法測定牛肉中磺胺類獸藥[J].分析化學，2013，41（4）：83-87.

[17]王志兵，王月，孟慶娟，等.硅膠固載離子液體-基質固相分散/高效液相色譜法測定禽肉與肝臟中8種磺胺類藥物殘留[J].分析測試學報，2013，32（9）：1044-1049.

[18]Shelver W L，Hakk H，Larsen G L.Development of an ultra-high-pressureliquidchromatography-tandemmass spectrometrymulti-residuesulfonamidemethodandits appilication to water，manure slurry and soils from swine rearing facilities[J].J Chromatogr A，2010，1217：1273-1282.

[19]Hummers W S，Offeman R E.Preparation of graphitic oxide [J].J Am Chem Sic，1958，80：1339.

[20]肖淑華，沈明，朱沛英，等.水合肼還原氧化石墨烯的研究[J].材料開發與應用，2011（1）：45-50.

[21]張長坤.磺胺甲惡唑和磺胺二甲嘧啶在大菱鲆體內的藥物代謝動力學研究[D].上海：上海海洋大學，2009.

[22]丁梨慧，邵雙良，任一平.液相色譜-電噴霧串聯四極桿質譜法檢測牛奶中磺胺類抗生素的殘留[C].杭州：浙江省科學技術協會，第十一屆全國離子色譜學術報告會論文集，2006.

[23]祝子銅.UPLC-MS-MS測定水產品中多種獸藥殘留研究[D].浙江：浙江工商大學，2011.

Graphene as a novel SPE adsorbent coupled with UPLC-MS/MS for the determination of sulfanilamide residues in black fish tissues

ZHENG Ting-lu1，DAI Zhi-yuan2，FANG Xu-bo1，CHEN Xiao-e1
（1.College of Food and Pharmacy，Zhengjiang Ocean University，Zhoushan 316022，China；2.College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China）

A rapid method for the simultaneous determination of thirteen sulfonamide（SAs）in black fish had been developed.The samples were extracted by MeOH and enriched by solid-phase extraction using a novel material-graphene as the sorbent.Chromatography separation was performed by UPLC and the detection was achieved by tandem mass spectrometry using ESI+and MRM mode.The method had a good linear range and the correlation coefficient was greater than 0.998.The limit of detection（LOD）ranging from 0.048 to 0.288μg/kg and the limit of quantization（LOQ）ranging from 0.160 to 0.960μg/kg were obtained.Average recoveries of individual sulfonamide were btween 70.6%and 93.8%.The proposed method was sensitive，effective and stable，which was satisfied with the need in application of detection of SAs residues in various aqutic matrixes aquatic products.

graphene；black fish；sulfonamide residues；solid-phase extraction；liquid chromatography-tandem mass spectrometry

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0071-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.006

2014－09－23

鄭婷璐（1987-），女，碩士研究生，助理實驗師，研究方向：水產品質量與安全。