重組人粒細胞集落刺激因子對腦缺血再灌注大鼠的神經保護和血管再生作用

鄧文靜 李東瑞 楚廣磊 滕軍放（通訊作者）

鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

粒細胞集落刺激因子（G-CSF）是一種細胞生長因子。近幾年，國內外的許多研究認為G-CSF 具有神經保護作用，所以推測G-CSF可能是治療腦缺血的有效措施。重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF）與天然G-CSF具有相同的生物學活性，更普遍的應用于臨床。因此本研究采用rhG-CSF作為干預藥物，擬通過局灶性腦缺血再灌注模型，觀察腦缺血大鼠的神經功能變化和血管再生的情況，進一步研究rhGCSF的神經保護機制。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 rhG-CSF 購自山東泉港藥業有限公司，CD105、VEGF兔抗鼠多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。

1．2 實驗動物分組與模型制備 健康雄性SD 大鼠，2～3個月，體質量280～320g，由鄭州大學基礎醫學院動物實驗研究中心提供。隨機分為假手術組（sham 組）、生理鹽水對照組（Nacl組）、rhG-CSF治療組。每組又隨機分為缺血治療后24h、7d和14d時間點組，每一時間點均為6只大鼠。采用改良的Longa［1］方法制作大鼠大腦中動脈閉塞MCAO 模型，動物模型缺血90min時再灌注。于再灌注開始，治療組予rhG-CSF 50μg／（kg·d），腹部皮下注射，連續5d。生理鹽水對照組予等量生理鹽水。分別于治療后24h、7d、14d時進行神經功能缺損評分。

1．3 神經功能評分與病死率統計 每只動物分別于缺血再灌注治療后24h、7d、14d進行神經功能缺損評分，具體方法采用chen等［2］制定的神經功能缺損評分標準（Nss）進行，觀察rhG-CSF對腦缺血大鼠神經功能的影響。

1．4 CD105、VEGF蛋白表達檢測 以10%水合氯醛將大鼠深度麻醉，斷頭取腦，以前囪為中心、冠狀面±1mm 腦片，每隔100μm 續作6μm 厚腦冠狀面石蠟切片。每只大鼠選5張大致相同部位計數陽性細胞數，經圖像分析系統得出積分光密度IOD，取其平均數。胞漿呈棕褐色著色者認為免疫反應陽性細胞。

1．5 統計學方法 采用SPSS 17．0軟件，所有實驗數據采用均數±標準差（±s）表示，病死率比較采用四格表χ2檢驗。神經功能評分比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student Newman Keuls Test SNK和Least Significant Difference Procedure LSD法檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 rhG-CSF對MCAO 大鼠病死率的影響 制作NacL組動物模型39只大鼠，rhG-CSF 治療組共進行24只動物模型制作，2組病死率比較差別有統計學意義（P＜0．05）。見表1。

2．2 神經功能缺損評分結果 NaCl組和rhG-CSF 治療組大鼠麻醉清醒后精神萎靡，左側肢體癱瘓，表現為站立不穩，或走路向偏癱側轉圈或傾倒。假手術組未發現此種情況。

缺血再灌注治療后24h，NaCl組和rhG-CSF 治療組較sham 組神經功能評分上升，差異有顯著性（P＜0．05）。缺血再灌注治療后7d時，NaCl組和rhG-CSF治療組較sham 組神經功能評分差異有顯著性（P＜0．05），rhG-CSF 治療組較NaCl組神經功能評分差異有顯著性（P＜0．05）。缺血再灌注治療后14d 時，各組兩兩比較差異均有顯著性（P＜0．05）。見表2。

2．3 各組大鼠腦組織缺血半暗帶VEGF蛋白的表達 免疫組化結果可見在神經細胞、血管內皮細胞及神經膠質細胞胞質呈棕黃色著色，此即VEGF 陽性表達。sham 組可見少量VEGF表達，缺血再灌注治療后7d和14d，NaCl組VEGF陽性表達要高于sham 組，差異有統計學意義（P＜0．05），rhG-CSF治療組VEGF 陽性表達要高于sham 組和NaCl組，差異有統計學意義（P＜0．05）。見表3、圖1。

表1 rhG-CSF對MCAO 大鼠病死率比較 ［n（%）］

表2 3組對大鼠神經缺損評分比較 （±s，n＝6）

表2 3組對大鼠神經缺損評分比較 （±s，n＝6）

注：以上數據經方差齊性檢驗和正態檢驗，均符合正態分布，方差具有齊性；與sham組比較，＊ P＜0．05，＊＊ P＜0．05；與NaCl組比較，△P＞0．05，△△P＜0．05

組別24h 7d 14d Sham 組0．50±0．55 3．50±0．55 3．33±0．52 NaCl組 8．50±0．55＊ 7．83±0．75＊ 7．83±0．75＊rhG-CSF治療組7．83±0．98＊＊△ 4．67±1．21＊＊△△4．50±0．55＊＊△△

表3 各組大鼠腦組織VEGF積分光密度比較 （±s，n＝6）

表3 各組大鼠腦組織VEGF積分光密度比較 （±s，n＝6）

注：以上數據經方差齊性檢驗和正態檢驗，均符合正態分布，方差具有齊性；與sham 組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．05，較之NaCl組，△P＜0．05

△

圖1 各組大鼠腦組織VEGF蛋白的表達（SP，×400）A：sham 組；B：NaCl組；C：rhG-CSF治療組1：7d；2：14d，3：21d

2．4 CD105染色觀察各組大鼠腦組織毛細血管密度 免疫組化結果可見血管內皮細胞中棕黃色顆粒沉積，即為CD105陽性表達。腦缺血再灌注治療后14d時，sham 組CD105染色顯示毛細血管稀疏，NaCl組毛細血管稍增多，可見膠質細胞浸潤，rhG-CSF治療組毛細血管明顯增多（P＜0．05）。見表4。

表4 各組大鼠腦組織CD105積分光密度 （±s）

表4 各組大鼠腦組織CD105積分光密度 （±s）

注：與sham 組比較，＊P＜0．05，與NaCl組相比，＊＊P＜0．05

組別24h 7d 14d Sham 組58．97±3．54 69．22±2．03 65．84±2．46 NaCl組 90．89±8．45＊ 110．32±10．15＊ 100．01±11．15＊rhG-CSF治療組 134．77±12．16＊＊ 133．29±13．46＊＊ 143．02±9．96＊＊

3 討論

本實驗應用rhG-CSF 治療腦缺血大鼠，觀察病死率發現，NaCl組病死率為53．8%，rhG-CSF 治療組病死率為25．0%，差別具有統計學意義（P＜0．05）。對腦缺血大鼠神經功能缺損評分顯示，缺血再灌注治療后7d 和14d 時，rhG-CSF治療組神經功能較NaCl組神經功能恢復較好。由此可見rhG-CSF能降低腦缺血大鼠病死率，提高神經功能，具有神經保護作用。

血管內皮生長因子VEGF（vascular endothelial factor）能促進血管的新生與重建，是針對血管內皮細胞最為特異的有絲分裂原。本實驗中缺血再灌注治療后7d和14d，rhGCSF治療組VEGF 陽性表達要高于sham 組和NaCl組，。CD105（Endoglin）蛋白是轉化生長因子家族中的一員，相較于其他血管標記因子，CD105多表達在新生血管的內皮細胞中，較大的血管基本不表達，特異性好，常被作為新生血管的特異標記分子之一［3］。本實驗中CD105免疫組化結果可見血管內皮細胞中棕黃色顆粒沉積，正常腦組織中，可以檢測微量的CD105，腦缺血再灌注治療后14d時，sham 組顯示毛細血管稀疏，NaCl組毛細血管稍增多，可見膠質細胞浸潤，rhG-CSF治療組毛細血管明顯增多。由此可見rhG-CSF 能促進缺血后腦組織VEGF 和CD105 的表達，標志著血管再生，這種促進血管再生作用能持續至腦梗死后14d，并且伴隨有神經功能的好轉。與Lee等［4-6］研究結果一致。

G-CSF促進血管再生的機制，目前認為有可能通過促使骨髓間充質細胞轉化為內皮細胞或者血管［7］，或通過促進單核細胞向缺血區募集進而促進血管生成［8］。在中樞神經系統，G-CSF被認為有可能通過旁分泌途徑刺激星形膠質細胞分泌血管內皮生長因子（VEGF）。

由以上結果可發現，rhG-CSF能改善腦缺血后大鼠的神經功能，其機制可能與促進血管再生有關。rhG-CSF作為一種新型的神經保護藥物，有望成為腦缺血神經保護研究的新方向。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in the rats［J］．Stroke，1989，20（1）：84-91．

［2］Chen J，Li Y，Wang L，et al．Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after ischemia in rats［J］．Stroke，2001，32（4）：1 005-1 011．

［3］Wikstrom P，Lissbrant IF，Stattin P，et al．CD105is expressed on immature blood vessels and is a marker for survival in prostate Caacer［J］．Prostate，2002，51（4）：268-275．

［4］Hayashi T，Deguchi K，Nagotani S，et al．Cerebral ischemia and angiogenesis［J］．Curr Neurovasc Res，2006，3（2）：119-129．

［5］Krupinski J，Kaluza J，Kumar P，et al．Role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic stroke［J］．Stroke，1994，25（9）：1 794-1 798．

［6］Lee ST，Chu K，Jung KH，et al．Granulocyte colony-stimulating factor enhances angiogenesis after focal cerebral ischemia［J］．Brain Res，2005，1058（1／2）：120-128

［7］Minamino K，Adachi Y，Okigaki M，et al．Macrophage colonystimulating factor（M-CSF），as well as granulocyte colonystimulating factor（G-CSF），accelerates neovascularization［J］．Stem Cells，2005，23（3）：347-354．

［8］Capoccia BJ，Shepherd BM，Link DC．G-CSF and AMD 3100 mobilize monocytes into the blood that stimulates angiogenesis in vivo through a paracrine mechanism［J］．Blood，2006，108（7）：2 438-2 445．