納米磁珠聯合質譜技術篩選大腸癌患者血清特異性蛋白標志物

陳盈 周永列 酈衛星 王歡?

納米磁珠聯合質譜技術篩選大腸癌患者血清特異性蛋白標志物

陳盈 周永列 酈衛星 王歡?

目的 通過納米磁珠聯合質譜技術篩選并鑒定大腸癌患者特異性蛋白標志物及在大腸癌早期診斷中的意義。方法 采用弱陽離子納米磁珠聯合MALDI-TOF-MS質譜技術分析102例大腸癌患者和124例健康對照者血清蛋白表達譜，并建立蛋白分類模型，采用LCQ液質聯用質譜（LC-MS）技術鑒定已篩選出的特異性蛋白，并用該模型在雙盲模式下從使用未建立模型的其它樣本中選取59例大腸癌血清標本（Dukes A、B、C期各33例、18例和8例）和正常體檢者90例進行檢測以驗證其診斷的準確性。結果 大腸癌組與健康對照組間有8個蛋白表達存在明顯差異（P＜0.05），其中大腸癌患者中有3個蛋白質高表達。差異蛋白質峰［質荷比（m/z）2963.17、4095.13、5906.83和38146.5］為最佳的大腸癌患者血清學診斷模型，敏感性為82.3%，特異性為90.3%，陽性預測值為90.3%，ROC曲線下面積為0.922。在雙盲模式下的診斷準確率為89.83%，排除率為94.44%。其差異蛋白峰和大腸癌的分期無明顯相關。LC-MS成功鑒定到m/z 2963.17（myosin-7B）、m/z 5906.83（Myoferlin）。結論 納米磁珠聯合質譜技術對大腸癌患者血清學診斷具有較高靈敏度和特異性，并通過LCQ液質聯用質譜成功鑒定到的myosin-7B和Myoferlin可能有助于大腸癌的早期診斷。

大腸癌 早期診斷 LCQ液質聯用質譜 肌球蛋白重鏈7B

大腸癌是常見的惡性腫瘤，已成為世界男性第三位、女性第二位高發的惡性腫瘤［1，2］。臨床上發現的大腸癌患者5年生存率＞90%，約有1/3的患者就診時已屬中晚期，且中位生存期僅數月［1，2］。本研究運用弱陽離子納米磁珠（MB-WCX）和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）對大腸癌患者與健康人血清中的蛋白質譜進行分析比較，并用LCQ液質聯用質譜（LC-MS）鑒定差異蛋白，以尋求大腸癌早期診斷的特異性蛋白標志物。

1 臨床資料

1.1 一般資料 本院2012年10月至2014年10月住院的大腸癌患者102例。男58例，女44例；年齡50～75歲，中位年齡66.5歲。病理分期：Dukes A期61例，Dukes B期31例，Dukes C期10例。取124例健康體檢者作為正常對照組，男72例，女52例；年齡49～77歲，中位年齡65歲。所有標本經病理學確診。本項目取得患者知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 弱陽離子磁珠為長春博坤生物科技有限公司，質譜儀為美國Biorad公司MALDITOF-MS PBSⅡc。液相色譜為Thermo公司的Surveyor系統，質譜為Thermo公司的Deca Xp plus系統。色譜柱為熱電公司BioBasic-18。尿素、U9裂解液（9M Urea，pH9.0）二硫蘇糖醇（DTT）、3-［3-（膽酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸鹽 （CHAPS）、三氟乙酸（TFA）、芥子酸（SPA）、乙腈（CAN）為美國Sigma公司。緩沖液（50mM NaAC，pH4.0）、SPA飽和液（50%ACN+1%TFA）、標準肽為Arg8-Vasopressin，Somatostatin，Bovine Insulin Beta-Chain，Human Insulin，Hirudin BHVK，質控血清樣品購自北京德易檢驗醫學中心。

1.3 方法 （1）標本采集：離心力1500g 離心5min后置-80℃冰箱保存。（2）樣品處理：取標本上清10μl與20μl U9裂解液混勻，振蕩冰浴孵育30min加370μl緩沖液稀釋。（3）弱陽離子納米磁珠的活化與蛋白捕獲：將10μl納米磁珠加入含有100μl緩沖液的PCR管并震蕩5min，棄液體；重復1次。在PCR管每孔中加100μl稀釋血清，600rpm，4℃震蕩1h，棄液體。每孔加100μl結合緩沖液，600rpm震蕩5min，棄液體；重復1次。每孔加200μl HPLC水，立刻棄出。1%TFA10μl加入PCR管中，5μl蛋白洗脫液加入5μl SPA飽和液，混合后取2μl點樣，風干后上機。（4）質譜分析：用5個標準肽對質譜儀進行校正，使系統質量偏差為0.1%，通過Ciphergen Pmteinchip 3.1軟件輔助完成數據讀取。（5）質控和重復性：每間隔7個樣品加入1個質控血清樣品，使蛋白表達譜平均變異系數（CV）＜10%。（6）LCQ液質聯用質譜分析：待測上清液放入超濾離心管中，10000 rpm，20 min離心后備用。MS/MS數據掃描5次，并用pFind Ver 2.6軟件進行IPI human Ver. 3.83數據庫檢索，參數：非特異酶切，無修飾位點，前體離子寬度為2 Da，產物離子寬度為0.5Da，肽段Score值＜1.0E-5。

1.4 統計學方法 采用Ciphergen Pmteinchip 3.1軟件和Biomarker Wizard 3.1軟件進行數據處理，峰值強度反映組與組間含量差異，過濾信噪比＜5的蛋白峰。采用SPSSl6.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大腸癌組與健康對照組血清蛋白表達譜 見表1。

表1 兩組8個差異蛋白質峰比較（x±s）

2.2 大腸癌患者血清蛋白標志物的篩選及診斷模型的建立 8個差異表達蛋白聚類分析結果顯示，4個蛋白質峰（m/z 2963.17、4095.13、5906.83和38146.5）為診斷大腸癌的最佳標志物，見圖1；該診斷模型的敏感性為82.3%，特異性為90.3%，陽性預測值為90.3%；大腸癌的ROC曲線下面積為0.922，見圖2。并發現4個差異蛋白質峰組成的生物標志物（m/z 2963.17、4095.13、5906.83和38146.5）不能將Dukes A、Dukes B和Dukes C期大腸癌患者準確的分組，與大腸癌的分期無明顯相關性（P＜0.05）。

2.3 LCQ液質聯用分析結果 4個大腸癌最佳標志物中有2個蛋白（m/z 4095.13、38146.5）因含量低而在純化過程中丟失；2個蛋白（m/z 2963.17、5906.83）已成功鑒定，其二級質譜圖見圖3。氨基酸序列顯示，m/z 2963.17和m/z 5906.83蛋白的肽段匹配。

圖1 大腸癌診斷模型圖（當蛋白峰符合以下條件M2963-17≤2．87212并且M5906-83＞ 17．1879 或者M2963-17＞ 2．87212 并且M38146-5≤0．032568并且M4095-13≤66．5569，則被模型判斷為大腸癌）

圖2 大腸癌診斷模型的ROC曲線

圖3 LCQ液質聯用所得到的二級質譜圖

3 討論

目前，腫瘤標記物如血清癌胚抗原（CEA）當前被廣泛用于大腸癌的篩選指標，但在其它消化道腫瘤中亦可明顯增高，且發現相當比例的大腸癌患者中CEA表達陰性［3，4］。纖維腸鏡等內鏡檢查由于具有創傷性，不適合健康人群的篩查。脫落細胞學檢查取材繁瑣，不易獲得滿意的標本，且陽性率低，其臨床應用受限［5］。

近年來，蛋白質組學的發展從整體上為了解惡性腫瘤的發生、發展提供較為理想的技術平臺［6～8］。本資料在大腸癌患者及健康者之間發現8個差異蛋白質峰，這種差異蛋白可能由于腫瘤細胞在侵襲過程中在不同階段所分泌的蛋白質不同，其中大腸癌患者有3個蛋白質呈高表達；而大腸癌患者血清學診斷模型發現4個蛋白質峰（m/z 2963.17、4095.13、5906.83、38146.5）為最佳診斷標志，具有較高的敏感性（82.3%）、特異性（90.3%）、陽性預測值（90.3%），與Deng等和Zhu等研究結果具有一致性［9，10］。對于建立的大腸癌血清蛋白質指紋圖譜診斷模型的驗證，作者選用了未建立模型的其他大腸癌血清樣本59例（Dukes A、B、C期分別為33例、18例和8例）和正常體檢者90例進行盲篩，得到該模型對大腸癌診斷的準確率為89.83%，排除率為94.44%。而對同樣的血清標本采用CEA進行檢測，準確率和排除率明顯低于質譜法。

LC-MS分析成功鑒定出m/z 2963.17和m/z 5906.83 2個蛋白。m/z 2963.17為 肌球蛋白重鏈7B（MYH7B myosin-7B），其在保證肌細胞正常工作中發揮著重要的作用［11］。m/z 5906.83為MYOF Isoform 1 of Myoferlin，研究表明，myoferlin與表達和膜的修復、重塑有關，干擾正常myoferlin表達可能提供抗增殖相關的治療作用［12］。Turtoi 等報道myoferlin在乳腺癌患者中存在過表達情況［13］；Wang 等發現myoferlin是一種新型的與預測胰腺癌預后相關的蛋白［14］。本研究提示，運用納米磁珠聯合質譜技術建立起多蛋白標志物構建的診斷模型篩選所得到的蛋白質譜在大腸癌早期診斷中具有較高靈敏度和特異性，該技術有望成為臨床早期診斷大腸癌的快速、高效、靈敏的檢測手段。并通過前述技術在大腸癌中篩查并鑒定出的兩種蛋白myosin-7B和 Myoferlin尤其是后者對大腸癌的早期診斷可能具有重要意義。

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Objective To screen and identify early specific protein markers of colorectal cancer （CRC）by MALDI-TOF-MS technology. Methods Weak cationic nano magnetic beads combined with MALDI-TOF-MS were used to profile differentially expressed proteins between 102 cases of CRC patients and 124 healthy controls in the serum protein，then constructing protein classification as diagnosis model and identifying specific proteins by LCQ liquid chromatography-mass spectrometry. Selected serum specimens of 59 patients with CRC and 90 normal healthy persons from samples in unestablished model were used to verify the accuracy of diagnosis. Results We found that eight difference protein peaks between CRC patients and healthy group（P＜0.05） and three proteins showed high expression in the CRC patients. A diagnostic model with four proteomic features（m/z 2963.17，4095.13，5906.83 and 38146.5） of CRC patients was generated using Biomarker Patterns Software 5.0 with best performance，the sensitivity was 82.3%，specificity was 90.3%，the positive predictive value was 90.3%，and area under the ROC curve was 0.922. The accuracy rate of diagnosis in double blind mode was89.83%，removal rate was 94.44%. The difference between the protein peaks and the staging of CRC hadno correlation. The identification results showed that m/z 2963.17 （MYH7B，myosin-7B） and m/z 5906.83 （MYOF Isoform 1 of Myoferlin） by LCQ mass spectrometry coupled with liquid. Conclusion Myosin-7B and Myoferlin screened by nano magnetic beads combined with MALDI-TOF-MS technology may contribute to early diagnosis of CRC.

Colorectal cancer Early diagnosis LCQ-LC-MS Myosin-7B

國家自然基金資助項目（81301406）；浙江省自然科學基金資助項目（LQ13H190005）

310014 浙江省人民醫院檢驗中心（陳盈 周永列 王歡）；

310014浙江省臨床檢驗中心（酈衛星）

*通訊作者