大腸癌不同發展階段相關基因甲基化定量分析的臨床意義

王群英 陳燕萍 葉曉華? 楊小云 丁進 姜洋

·基礎研究·

大腸癌不同發展階段相關基因甲基化定量分析的臨床意義

王群英 陳燕萍 葉曉華? 楊小云 丁進 姜洋

目的 通過進行大腸癌患者相關基因甲基化定量分析，探討相關基因甲基化水平與大腸癌發生、發展的關系。方法 采用實時熒光定量PCR技術檢測大腸癌組、癌前病變組（結腸腺瘤）及正常對照組的APC、p16及大腸癌特異性基因Vimentin基因甲基化水平。結果 大腸癌組中APC、p16及Vimentin基因甲基化陽性率比較癌前病變（結腸腺瘤）和正常腸黏膜組顯著升高，其差異有統計學意義（P＜0.05）；大腸癌組中腫瘤組織的APC、p16及Vimentin基因甲基化陽性率比癌旁及正常黏膜組織顯著升高，其差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 APC、p16及Vimentin基因甲基化參與了大腸癌的發生發展，且利用實時熒光定量PCR對相關基因甲基化進行定量分析可能預測大腸癌早期發生。

熒光定量 甲基化 大腸癌

Objective To investigate the relationship between methylation of relevant genes and the development of colorectal cancer and to assess the value of early diagnosis based on quantitative analysis of methylation of colorectal cancer-related genes. Methods Fluorogenic quantitative polymerase chain reaction （PCR） was applied to detect APC，p16，and colorectal cancer-specific Vimentin gene methylation in colorectal cancer，precancerosis and healthy control groups，respectively. The levels of APC，p16 and Vimentin methylation in different tissues of patients with colorectal cancer were also quantified. Results The methylation rates of the APC，p16 and Vimentin in colorectal cancer group were significant up-regulated compared to those in precancerosis and healthy control groups （P＜0.05）. Moreover，similar results were also obtained for the levels of APC，p16 and Vimentin methylation in the malignancy，pericarcinomatous and normal tissues in colorectal cancer group （P＜0.05）. Conclusions The methylation of APC，p16 and Vimentin is involved in the carcinogenesis of colorectal cancer. Quantitative analysis of methylation of colorectal cancer-related genes using fluorogenic quantitative PCR may be used for early diagnosis of colorectal cancer.

【Kew words】 Fluorogenic quantitative Methylation Colorectal cancer early diagnosis of colorectal cancer.

大腸癌是人類主要惡性腫瘤之一，在我國一些大城市呈上升趨勢［1］。闡明大腸癌發病的分子機制對進一步篩選大腸癌分子靶點和治療疾病具有重要意義。腫瘤相關基因的CpG島甲基化所致基因轉錄失活已成為腫瘤表觀基因組學研究的重點內容。但限于檢測方法或技術，目前對基因甲基化主要采取定性的檢測和研究。本文擬以此為切入點，通過對細胞修復基因以及大腸癌特異性表達基因甲基化程度的定量檢測［3］，探討其甲基化程度與大腸癌的發生及不同發展階段的相關性，初步揭示其內在關系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 標本取自本院2009年6月至2010年12月的腸鏡活檢標本，其中包括：（1）大腸癌組62例，男34例，女28例；平均年齡（59±7.4）歲。包括低、中、高分化腺癌3類患者。（2）癌前病變組（結腸腺瘤）54例，男28例，女26例；平均年齡（55±6.7）歲。主要腸鏡檢查為息肉，活檢或術后標本病理檢查示腺瘤患者，包括管狀腺瘤，絨毛狀腺瘤及混合型腺瘤，伴或不伴異型增生。（3）健康對照組48例，男24例，女24例；平均年齡（50±5.6）歲。否認有高血壓，糖尿病，冠心病等慢性病。新鮮標本置于液氮中，隨后置于-80℃低溫冰箱中保存備用。

1.2 主要試劑 BiosPin組織基因組DNA提取試劑盒； 瓊脂糖； 100-1000bp DNA Ladder；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒；DNA Clean-up純化試劑盒（Promega）；Realtime PCR Master Mix （TOYOBO）；Taq酶 （Fermentas-MBI）；Tag酶Buffer （Fermentas-MBI）；dNTPs （Fermentas-MBI）；Mg2+ （Fermentas-MBI）；DMSO。

1.3 方法 （1）組織DNA提取：標本DNA抽提采用BiosPin組織基因組DNA提取試劑盒（艾比根生物技術），每 300 μl 血清獲得70μl 的DNA，所有保存血清標本均采用同一批號的試劑盒抽提 DNA 以減少批間誤差 ，并統一集中檢測。紫外分光光度計及1%的瓊脂糖凝膠檢測DNA濃度和純度（A260/A280＞1.8）。將提取的DNA置于-20℃冰箱中保存備用。（2）DNA亞硫酸氫鹽處理和純化：取提取的DNA 10μg加入5.5 μl 的 NaOH（3mol/L），于37℃ 變性10min。加入10mM氫醌20 μl，和3M亞硫酸氫鈉520 μl，上蓋200 μl礦物油于50℃水浴16 h。（3）于礦物油下小心吸取50Oμl液體，置于新的Eppendorf管，加入1ml 37℃預熱后冷卻至30℃的 Wizard DNA純化樹脂，顛倒混勻。隨后加入3M NaOH 5.5 μl，室溫變性10min（脫硫）。加入3M醋酸鈉5.5 μl（中和NaOH）和冷無水乙醇120μl，沉淀回收DNA于-20℃放置6h。置入-20℃冰箱中貯存備用，以此作為聚合酶鏈反應 （PCR）擴增模板。（3）引物合成：根據文獻［4～6］設計出針對亞硫酸氫鹽修飾后的APC 、p16及大腸癌特異性基因Vimentin基因甲基化和非甲基化引物序列，引物由依托實驗室（上海捷瑞）合成。具體引物序列如下： 甲基化的APC（APC-M）：上游引物5'-3'：TAT TGC GGA GTG CGG GTC，下游引物5'-3'：TCG ACG AAC TCC CGA CGA擴增目的條帶大小為98bp。非甲基化的APC（APC-UM）：上游引物5'-3'：GTG TTT TAT TGT GGA GTG TGG GTT，下游引物5'-3'：CCA ATC AAC AAA CTC CCA ACA A，擴增目的條帶大小為104bp。甲基化的p16（P16-M）：上游引物Sense Primers5'-3'：TTA TTA GAG GGT GGG GCG GAT CGC，下游引物Antisense Primers5'-3'：GAC CCC GAA CCG CGA CCG TAA，擴增目的條帶大小為150bp。非甲基化的p16（P16-UM）：上游引物5'-3'：TTA TTA GAG GGT GGG GTG GAT TGT，下游引物5'-3'：CAA CCC CAA ACC ACA ACC AIA A，擴增目的條帶大小為151bp。甲基化的Vimentin （Vimentin-M）：上游引物5'-3'：TCG TTT CGA GGT TTT CGC GTT AGA GAC，下游引物：5'-3'： CGA CTA AAA CTC GAC CGA CTC GCG A，擴增目的條帶大小為216bp。非甲基化的Vimentin（Vimentin-UM）：上游引物5'-3'： TTG GTG GAT TTT TTG TTG GTT GAT G，下游引物5'-3'：CAC AAC TTA CCT TAA CCC TTA AAC TAC TCA，擴增目的條帶大小為224 bp。

圖1 基因組DNA電泳圖

1.4 統計學方法 采用SAS9.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以n或%表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織基因組DNA的提取 通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定 DNA的濃度與純度，結果示OD260/ OD280均介于1.8～2.0，瓊脂糖凝膠電泳呈現單一的和基因組DNA大小相符的條帶，說明DNA的純度較高，完整性較好（圖l）。

2.2 各基因甲基化檢測結果 大腸癌、癌前病變（結腸腺瘤）和正常腸黏膜組pl6甲基化陽性率分別為51.61%、31.48%、14.58%；APC基因甲基化陽性率分別為77.42%、46.29%、6.25%； Vimentin基因甲基化陽性率分別為66.13%、51.85%、4.17%；大腸癌、癌前病變（結腸腺瘤）和正常腸黏膜組各基因甲基化陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05），任意兩組之間陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 p16，APC和Vimentin基因的甲基化檢測結果（n）

2.3 各基因定量檢測水平 對大腸癌、癌前病變（結腸腺瘤）及正常組織病變中p16，APC，Vimentin基因甲基化定量水平進行比較發現，三組之間甲基化定量水平差異有統計學意義 （P＜0.05），任意兩組之間比較差異有統計學意義 （P＜0.05），由正常組織、癌前病變（結腸腺瘤）到大腸癌各基因甲基化的定量水平呈上升趨勢 （P＜0.05）。

2.4 各基因在大腸癌不同組織中甲基化程度檢測結果 對62例大腸癌患者的不同組織各基因甲基化程度定量測定。腫瘤、癌旁組織（癌癥病灶周圍5cm組織）及正常的大腸黏膜組織pl6、APC、Vimentin基因甲基化程度比較差異有統計學意義（P＜0.05），任意兩組之間陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

大腸癌從誘發到進展是一個多階段、多因素的復雜過程。抑癌基因是正常細胞在調控細胞增殖、分化等方面起重要作用的基因，它在保持基因組結構穩定、促進細胞生長、誘導細胞凋亡等方面均有重要意義，它的缺失或失活可引起細胞內癌基因的活化，造成細胞的過度增生、分化，導致惡性腫瘤的發生和發展。DNA甲基化的異常能導致腫瘤的發生。近年來發現腫瘤細胞中出現染色體區域性高甲基化與抑癌基因功能的丟失有關，可能是腫瘤甲基化不平衡中的重要部分，基因啟動子區域5'CPG島甲基化常伴有基因的轉錄失活。

大腸腺癌息肉病基因 （APC）與大腸腺癌發生密切相關［7］。APC基因是由Herrera等［8］于1986年對1例格-德納綜合征患者進行細胞遺傳學研究時發現的一個抑癌基因，并于1991年從結腸癌中首先克隆出這一基因，并正式命名為DP2、5或APC［9］。早期研究［7］發現該基因不僅與家族性結腸腺瘤息肉病（FAP）有關，而且在散發性大腸癌（SCRC）中亦起著重要作用。Chop等［10］采用免疫沉淀技術也證實大腸癌組織中缺乏野生型 APC蛋白，提示APC蛋白失表達可能與大腸癌的發生與演進密切相關。APC基因可能是散發型大腸癌的易感基因，但APC基因的突變可能無助于大腸癌的預后。檢測APC基因對早期診斷及治療大腸癌有著重要的指導意義。

p16基因［11］是一種細胞周期中的基本基因，直接參與細胞周期的調控，負調節細胞增殖及分裂，在人類50%腫瘤細胞株純發現有純合子缺失，突變，會導致細胞惡性增殖，導致惡性腫瘤發生。pl6基因位于第9號染色體短臂上，全長8.5Kb，由3個外顯子和2個內含子組成。5'端第1外顯子有126bp，中間307bP構成第2個外顯子，3'端第3個外顯子有116bp；3個外顯子構成1個開放閱讀框架，共同編碼分子量為15.84KD、由145個氨基酸組成的單鏈蛋白質，即pl6蛋白。P16基因已經在肺癌等多種腫瘤中發現純合子缺失以及無義，錯義及移碼突變，表明p16基因以缺失，突變方式廣泛參予腫瘤形成，檢測p16基因有無改變對判斷患者腫瘤的易感性以及預測腫瘤的預后，具有十分重要的臨床意義。研究發現pl6基因與多種腫瘤的發生有關［12］，因此又稱為多腫瘤抑制基因（MTSI）。APC 、p16及大腸癌特異性基因Vimentin基因屬于細胞周期素依賴性激酶4（CDK4）抑制因子家族成員之一，其產物APC、p16及大腸癌特異性基因Vimentin蛋白競爭性結合CDK4，抑制其激酶活性，維持pRb蛋白的去磷酸化，使細胞分裂阻滯于G0期而抑制細胞的增殖。pl6基因失活使APC、p16及大腸癌特異性基因Vimentin INK4a/pRb調節通路異常，致使細胞過度增殖而導致腫瘤的發生，其主要失活機制有基因突變、純合性缺失和啟動子甲基化。pl6基因作為抑癌基因，其5'端啟動子調節序列及第一外顯子均含有CpG島，這些區域在正常組織中一般是非甲基化的，但在一些常見的腫瘤中卻呈高甲基化，近年來發現腫瘤細胞中出現染色體區域性高甲基化與抑癌基因功能的丟失有關，可能是腫瘤甲基化不平衡中的重要部分，基因啟動子區域5'CPG島甲基化常伴有基因的轉錄失活。CPG島是基因組C、G富集區，細胞中約有40%的基因啟動子區域具有CPG島。正常情況下，除失活的X染色體外，常染色體基因CPG島均處于非甲基化狀態，而在細胞癌變過程中（包括頭頸部腫瘤）常染色體基因CPG島存在廣泛的甲基化，p16基因的外顯子1啟動子區域存在一CPG島，在被檢測的正常組織中它處于非甲基狀態。在一些p16等位基因較少發生點突變或純合性缺失的人類腫瘤中，如小細胞肺癌株出現高比例（78%）的5'CPG島甲基化而失去轉錄活性，特別是結腸癌細胞系中甲基化發生率高達97%，尤其是在一些未發生純合性缺失的結腸癌細胞中，p16基因的兩個等位基因都出現異常甲基化，并與其完全失活是相關的。后來又發現在結腸癌患者的正常結腸黏膜也出現甲基化，這在正常細胞常染色體基因中是罕見的，一般島都是非甲基化的。pl6基因由于純合性缺失和突變而失活已在眾多腫瘤中進行了研究，但這兩種遺傳變異方式還不能夠充分解釋APC 、P16及大腸癌特異性基因Vimentin蛋白的高丟失率，而APC、P16及大腸癌特異性基因Vimentin基因cpG島高甲基化已被證實是APC 、p16及大腸癌特異性基因Vimentin蛋白丟失的另一重要機制［13］。最近的研究結果表明，在眾多腫瘤中，pl6基因啟動子高甲基化是造成APC 、p16及大腸癌特異性基因Vimentin蛋白丟失的主要原因。在原發性大腸癌中APC 、P16及大腸癌特異性基因Vimentin基因缺失突變少見，但APC、p16及大腸癌特異性基因Vimentin蛋白有較高的失表達率，因此pl6基因在大腸癌中的失活可能存在其他機制。

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