水飛薊寡肽對(duì)小鼠肝線粒體損傷的保護(hù)作用

朱淑云 沙 莎 秦云云 董 英

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

水飛薊寡肽對(duì)小鼠肝線粒體損傷的保護(hù)作用

朱淑云 沙 莎 秦云云 董 英

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

研究水飛薊寡肽對(duì)羥自由基（·OH）致小鼠肝細(xì)胞線粒體氧化損傷的保護(hù)作用。采用·OH誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞線粒體氧化損傷，通過(guò)測(cè)定線粒體腫脹度、丙二醛含量、琥珀酸脫氫酶及ATP酶活性、線粒體膜電位和膜流動(dòng)性等指標(biāo)，研究水飛薊寡肽對(duì)·OH引起的體外氧化損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明水飛薊寡肽可顯著抑制小鼠肝細(xì)胞線粒體的腫脹，降低丙二醛的含量，可顯著增強(qiáng)琥珀酸脫氫酶和ATP酶活性，維持線粒體膜電位和膜流動(dòng)性，在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，以高濃度組效果最好。研究證明水飛薊寡肽可以抑制·OH所致的小鼠肝細(xì)胞線粒體氧化損傷，其機(jī)制可能與清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。

水飛薊寡肽 線粒體 羥基自由基 抗氧化

正常情況下，機(jī)體內(nèi)的自由基維持在一個(gè)正常的生理水平上，在某些病理情況或機(jī)體衰老的情況下，自由基的產(chǎn)生和消除失去平衡，就會(huì)導(dǎo)致氧化損傷，從而引發(fā)疾病。機(jī)體可以通過(guò)補(bǔ)充抗氧化劑來(lái)減緩自由基引起的氧化損傷。近年來(lái)，生物活性肽作為一種新型的天然抗氧化劑的研究正在興起，這些抗氧化肽類(lèi)能在一定程度上減輕機(jī)體的氧化損傷，減少疾病的發(fā)生，正逐漸顯示出他們?cè)卺t(yī)藥和食品等領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)［1-2］。

水飛薊（Silybum Marianum L.Gaertn）作為一種傳統(tǒng)的藥用植物，其藥用有效成分水飛薊素主要存在于水飛薊籽殼中［3］，籽仁中蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸種類(lèi)齊全，而有關(guān)水飛薊蛋白的研究報(bào)道較少，作者前期研究發(fā)現(xiàn)以水飛薊蛋白為原料制得的酶解物具有較強(qiáng)的抗氧化活性［4-5］，但蛋白酶解物是一個(gè)比較復(fù)雜的混和物，其中存在著分子質(zhì)量大小不同的多種物質(zhì)，研究表明多肽的分子質(zhì)量大小與其抗氧化活性密切相關(guān)［6］，作者的前期研究也發(fā)現(xiàn)，水飛薊多肽分子質(zhì)量的大小會(huì)影響其抗氧化活性，其中以分子質(zhì)量＜1 ku的寡肽清除自由基的活性最強(qiáng)。因此，本試驗(yàn)以分子質(zhì)量＜1 ku的水飛薊寡肽為原料，研究其對(duì)·OH所致的小鼠肝線粒體氧化損傷的保護(hù)作用，以期為水飛薊蛋白資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

水飛薊寡肽（SMO）：按照文獻(xiàn)［5］方法制得蛋白酶解物，再用截留分子質(zhì)量為10、3、1 ku的超濾膜進(jìn)行分級(jí)制備，將透過(guò)1 ku超濾膜的酶解液濃縮后冷凍干燥即得＜1 ku的水飛薊寡肽。

昆明種小鼠，8周齡，體重（25±2）g：江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

羅丹明123（Rhodamine123）：碧云天生物技術(shù)研究所；Na+-K+-ATPase試劑盒、Ca2+-Mg2+-ATPase試劑盒、琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒：南京建成生物工程研究所；DPH（1，6-Diphenylhexa-1，3，5-triene）：Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾系統(tǒng)：美國(guó)Millipore儀器公司；ALPHAI-4／2-4型冷凍干燥機(jī)：德國(guó) CHRIST公司；Agilent 1100液相色譜：美國(guó)安捷倫公司；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司；CARY ECLIPSE熒光分光光度計(jì)：美國(guó)VARIAN公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠肝細(xì)胞線粒體的提取

參照 Bao等［7］的方法制備小鼠肝細(xì)胞線粒體懸液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定懸液中的蛋白質(zhì)含量，-20℃保存待用。

1.3.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組

試驗(yàn)分為空白組、模型對(duì)照組、各濃度水飛薊寡肽（SMO）組。每組做6個(gè)平行。

1.3.3 肝細(xì)胞線粒體腫脹度的測(cè)定

［8］并略作修改。3.0 mL反應(yīng)液中含有1.0 mg線粒體蛋白質(zhì)，各加入不同濃度水飛薊寡肽，以 1 mL FeSO4（15μmol／L）和 0.8 mL Vc（0.375 mmol／L）溶液誘導(dǎo)線粒體腫脹，37℃恒溫水浴緩慢振蕩，不同時(shí)間取出測(cè)A520nm。線粒體膜受氧化損傷而發(fā)生腫脹，吸光值會(huì)下降。

1.3.4 肝細(xì)胞線粒體丙二醛（MDA）含量的測(cè)定［9］

取1 mL蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的肝線粒體懸液，加入不同濃度的寡肽，再加入6 mmol／L FeSO4100μL，最后加50μmol／L Vc 50μL。在37℃下，水浴1 h，加入15%TCA 1 mL結(jié)束反應(yīng)，再加入0.67%TBA 1 mL，于沸水浴中顯色15 min，冷卻后離心，測(cè)A532nm，以吸光度表示MDA含量多少，吸光值越大，MDA含量越高。

式中：A1為模型對(duì)照組的吸光度；A2為樣品組的吸光度。

1.3.5 肝細(xì)胞線粒體ATPase和SDH活性的測(cè)定

配制蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的肝線粒體懸液，分別加入不同濃度的寡肽，100 mmol／L FeSO4和 50 μmol／L VC誘導(dǎo)線粒體氧化損傷，各組在37℃下水浴30 min，加入1 mmol／L EDTA終止反應(yīng)，具體測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行。

1.3.6 肝細(xì)胞線粒體膜電位（ΔΨm）的測(cè)定

參考文獻(xiàn)［10］并略作修改。將肝線粒體懸液于8 800 r／min離心10 min，棄上清，沉淀用已加入Rh123（30 nmol／L）的膜電位測(cè)試液（pH7.2，225 mmo1／L甘 露 醇，70 mmol／L蔗 糖，5 mmo1／L HEPES）重懸，調(diào)整其蛋白質(zhì)含量至 0.5 mg／mL。取線粒體懸液3 mL，加入0.2 mL不同濃度的寡肽，空白組和模型對(duì)照組加等體積的去離子水。混勻后在37℃孵育3 min，然后加入終濃度30μmol／L的 FeSO4和終濃度500μmol／L的VC，混勻后37℃避光孵育20 min，然后離心去除未吸收的Rh123。加入膜電位測(cè)試液重懸均勻后，測(cè)定線粒體懸液的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)505 nm，發(fā)射波長(zhǎng)534 nm），以熒光強(qiáng)度值反映線粒體膜電位（ΔΨm）的變化。

1.3.7 肝細(xì)胞線粒體膜流動(dòng)性的測(cè)定［11］

總體積3 mL反應(yīng)液中含線粒體蛋白0.5 mg和不同濃度寡肽，加入3 mmol／L FeSO4和50 mmol／LVC啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)30min，加入1mmol／L EDTA終止反應(yīng)，加入 20 umol／L的 DPH 50μL，37℃反應(yīng)40 min，離心，用磷酸緩沖液洗1次，再用相同體積緩沖液重懸。以激發(fā)波長(zhǎng)361 nm，發(fā)射波長(zhǎng)431 nm測(cè)熒光強(qiáng)度 Ivv、Ivh、Ihv、Ihh，其中 v表示偏振光為垂直方向，h為水平方向，前腳注是發(fā)射光，后腳注是激發(fā)光。按下式計(jì)算，式中G＝Ihv／Ihh：

1.3.8 水飛薊寡肽的氨基酸組成分析

采用酸水解法［12］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水飛薊寡肽對(duì)肝線粒體腫脹度的影響

Fe2+-VC體系可發(fā)生Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，·OH可與線粒體膜上多不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化損傷反應(yīng)。脂質(zhì)過(guò)氧化作用是一種連鎖反應(yīng)，它可以連續(xù)產(chǎn)生自由基，而自由基又可進(jìn)一步推動(dòng)過(guò)氧化反應(yīng)，這種鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大了活性氧的作用，改變了膜的流動(dòng)性和通透性，進(jìn)而加劇了線粒體的腫脹，而線粒體的腫脹會(huì)引起外膜破裂，從而使線粒體體積增大，光密度下降，所以通過(guò)測(cè)定吸光度值的變化可以反映線粒體的腫脹程度。水飛薊寡肽對(duì)線粒體腫脹度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 水飛薊寡肽對(duì)小鼠肝線粒體腫脹的影響

由圖1可見(jiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組A520nm均有下降，模型對(duì)照組下降的幅度最大，說(shuō)明·OH誘導(dǎo)加速了線粒體的氧化損傷，使其腫脹加重。在考察的時(shí)間范圍內(nèi)，水飛薊寡肽對(duì)線粒體氧應(yīng)激腫脹具有明顯的干預(yù)作用，且具有量效關(guān)系。表明水飛薊寡肽可通過(guò)清除·OH而減輕其對(duì)線粒體的氧化損傷，使損傷程度降低，腫脹減輕。

2.2 水飛薊寡肽對(duì)肝線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

丙二醛（MDA）是自由基對(duì)不飽和脂肪酸引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用的產(chǎn)物，其可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，所以通過(guò)測(cè)定532 nm處的吸光度可以反映MDA的相對(duì)含量，并間接地反映出機(jī)體氧化損傷程度的高低。水飛薊寡肽對(duì)MDA生成的影響見(jiàn)表1。

表1 水飛薊寡肽對(duì)小鼠肝線粒體MDA的影響（n＝6，ˉx±SD）

由表1可見(jiàn)，模型對(duì)照組小鼠肝線粒體MDA含量較空白組明顯升高，差異顯著（P＜0.01），水飛薊寡肽組均較模型組有明顯降低（P＜0.01），表明Fe2+-VC體系激發(fā)的活性氧通過(guò)攻擊線粒體膜中的多不飽和脂肪酸，產(chǎn)生了大量的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA，通過(guò)添加水飛薊寡肽，能夠顯著抑制MDA的產(chǎn)生，減輕線粒體膜氧化損傷的程度。另外，多肽對(duì)MDA生成的抑制作用還具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，9 mg／mL寡肽對(duì)MDA生成的抑制率達(dá)到了43.07%，略?xún)?yōu)于油菜花粉酶解物［13］。

2.3 水飛薊寡肽對(duì)肝線粒體Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase和SDH的影響

細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase可以維持細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+等內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡和跨膜電化學(xué)梯度，在細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和能量代謝等方面起重要作用。當(dāng)Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量生成和離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，從而破壞膜電位，引起線粒體損傷［14］。琥珀酸脫氫酶（SDH）是參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可以為線粒體呼吸鏈提供電子，是線粒體的標(biāo)志酶，其活性對(duì)于評(píng)價(jià)線粒體功能具有重要意義［15］。水飛薊寡肽對(duì)小鼠肝線粒體 Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase和 SDH的影響見(jiàn)表2。

表2 水飛薊寡肽對(duì)小鼠肝線粒體ATPase和SDH活性的影響（n＝6，ˉx±SD）

氧化應(yīng)激引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)可使膜上的磷脂發(fā)生交聯(lián)，使膜上的脂質(zhì)分子排列的有序性及分子運(yùn)動(dòng)改變，從而引發(fā)膜的流動(dòng)性下降，導(dǎo)致膜酶活性下降。由表2可以看出，模型對(duì)照組小鼠的Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase和 SDH活性與空白組相比顯著下降（P＜0.01），水飛薊寡肽可顯著提高 Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase和SDH活性，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。水飛薊寡肽能有效抑制氧化應(yīng)激所致的3種酶的活性下降，說(shuō)明其具有維持線粒體結(jié)構(gòu)完整性和保護(hù)線粒體的功能。

2.4 水飛薊寡肽對(duì)肝線粒體膜電位的影響

羅丹明123（Rh123）是一種脂溶性的、陽(yáng)離子熒光探針，容易被有活性的線粒體攝取，能選擇性地被帶負(fù)電荷的線粒體膜所吸收而發(fā)出綠色熒光，當(dāng)線粒體跨膜電位下降時(shí)，線粒體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，電負(fù)性降低，線粒體積聚Rh123的能力也下降，熒光強(qiáng)度降低。所以可用Rh123作為線粒體跨膜電位的指示劑，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定 ΔΨm的變化［16］。水飛薊寡肽對(duì)肝線粒體膜電位的影響見(jiàn)圖2。

圖2 水飛薊寡肽對(duì)小鼠肝線粒體膜電位（ΔΨm）的影響

由圖2可知，模型對(duì)照組線粒體膜電位較空白組明顯下降，差異顯著（P＜0.01），說(shuō)明 Fe2+-VC作用于線粒體，引起了線粒體跨膜電位的顯著降低；水飛薊寡肽組與模型對(duì)照組相比，膜電位有顯著的提高，中劑量組和高劑量組的效果相近。表明水飛薊寡肽能減緩氧化損傷引起的線粒體膜電位的下降，具有保護(hù)線粒體、減輕氧化應(yīng)激損傷的作用。

2.5 水飛薊寡肽對(duì)肝線粒體膜流動(dòng)性的影響

細(xì)胞膜的流動(dòng)性通常是指細(xì)胞膜上膜脂質(zhì)的運(yùn)動(dòng)特性。適宜的膜流動(dòng)性是維持細(xì)胞膜正常功能的必要條件，它與細(xì)胞的信息傳遞、物質(zhì)和能量交換等功能具有密切的關(guān)系。因此，膜流動(dòng)性是反映細(xì)胞功能狀態(tài)的一項(xiàng)重要而敏感的指標(biāo)。研究表明，細(xì)胞膜流動(dòng)性的降低與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，如肝硬化、冠心病、腎臟疾病等［17］。水飛薊寡肽對(duì)肝線粒體膜流動(dòng)性的影響見(jiàn)表3。

表3 水飛薊寡肽對(duì)小鼠肝線粒體膜流動(dòng)性的影響（n＝6，ˉx±SD）

熒光偏振度（P）和微黏度（η）是膜流動(dòng)性大小的指標(biāo)，P和η越大，膜的流動(dòng)性越小。由表3可見(jiàn)，空白組的 P為0.22，η為2.04，模型對(duì)照組 P為0.33，η為5.01，與空白組相比有顯著升高（P＜0.01），由此可知，·OH可使線粒體膜氧化損傷而導(dǎo)致膜的流動(dòng)性降低。而水飛薊寡肽可顯著提高線粒體膜的流動(dòng)性（P＜0.01），表明水飛薊寡肽能夠抑制·OH的產(chǎn)生，從而減輕肝線粒體的氧化應(yīng)激損傷，起到保護(hù)線粒體的作用。

2.6 水飛薊寡肽的氨基酸組成分析

樣品前處理采用酸水解法，因此色氨酸的含量未進(jìn)行檢測(cè)，其他氨基酸的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 水飛薊寡肽中氨基酸的組成與含量／g／100 g肽

由表4可知，水飛薊寡肽中氨基酸含量豐富，種類(lèi)齊全，其中支鏈氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)16.96%，支鏈氨基酸不僅是合成機(jī)體蛋白質(zhì)的基本原料，還具有多種重要的生物功能，可影響蛋白質(zhì)的合成和分解代謝、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，是一種重要的運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑，近來(lái)研究其還具有抗氧化、抗衰老的功能［18］。水飛薊寡肽中幾種主要抗氧化氨基酸（His、Tyr、Met、Cys）質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)11.72%，它們是水飛薊寡肽具有抗氧化活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

水飛薊寡肽可顯著抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠肝線粒體腫脹和MDA的生成，提高由氧化應(yīng)激引起的Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase和 SDH活性的降低，對(duì)線粒體膜電位和膜流動(dòng)性的降低也有顯著的抑制作用，表明其具有保護(hù)線粒體氧化損傷的功能。水飛薊寡肽中富含酸性氨基酸Glu和Asp，支鏈氨基酸和抗氧化氨基酸的含量較高，是其具有抗氧化活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Protective Effect of Silybum marianum Oligopeptides on Mice Liver Mitochondrial Damage

Zhu Shuyun Sha Sha Qin Yunyun Dong Ying
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

To study the protective effect of Silybum marianum oligopeptides（SMO）on themice livermitochondria damage by hydroxyl radicals（·OH）.The swelling degree，the contentofmalondialdehyde（MDA），the activities of Succinate dehydrogenase（SDH）and ATPase，membrane potential and membrane fluidity ofmice livermitochondria were measured.The protective effect of Silibum marianum oligopeptides on oxidative damage in vitro is caused by OH.The results indicated that，SMO could inhibit the swelling of livermitochondria and reduce the MDA content in mice.It also could improve the activities of SDH and ATPase，and maintain livermitochondriamembrane potential and membrane fluidity.Within the test dose range，the high dose group of SMO had the best effect.This study proved that SMO had the effects of inhibiting themice livermitochondria injury induced by·OH.Themechanism may be related to free radical scavenging and the inhibition of lipid peroxidation.

Silibum marianum oligopeptides，mitochondria，hydroxyl radical，anti-oxidation

TS201

A

1003-0174（2015）01-0097-05

江蘇省鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科技支撐（NY2012031）

2013-10-29

朱淑云，女，1975年出生，副教授，食品科學(xué)與工程

董英，女，1954年出生，教授，食品生物技術(shù)、農(nóng)產(chǎn)品深加工與綜合利用