高壓對蛋白質結構和酶解及功能性質的影響研究進展

李 鳳，魏 明，吳照民，韓珍瓊

(1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽621010;2.西南科技大學食品科學技術研究所，四川綿陽621010)

蛋白質的功能性質對食品生產加工、儲藏和產品的品質都有直接的影響［1］。大豆蛋白、花生蛋白等植物蛋白因功能性質較差其應用也受到限制。蛋白質的大小、極性和非極性殘基、分子柔韌性、帶電荷情況和氨基酸組成等結構特征都會影響蛋白質的功能性質［2］。因此，改善蛋白質功能性質一直受到研究者關注。改性的方法包括化學、熱處理、酶法和高壓處理等［3-7］。高壓技術在牛奶保藏方面的作用在100年前就被人們認識。但是直至20世紀90年代高壓技術在食品中的應用才受到真正重視和推廣。一方面是高壓處理可通過抑制或殺滅食品中有害微生物和酶延長食品保質期［8-11］;另外，高壓可通過改變生物大分子的結構而改善食品的功能特性。高壓處理使蛋白質的疏水基團暴露、去分子折疊以及聚集而改變蛋白質的功能性質［9，12-14］，并且高壓處理還能促進蛋白質的酶解改性。高壓不但加快蛋白酶解速度、提高降解率并且影響產物種類。目前的報道主要是關于高壓和酶解結合處理后蛋白質降解程度和降解速度的變化;不同離子強度、溫度和不同pH條件下高壓處理結果的比較;高壓和酶解處理后蛋白質功能性質改變;高壓與不同蛋白酶結合的處理結果比較等方面的研究。筆者對現有的研究進展進行總結。

1 高壓對蛋白質結構的影響

高壓可能給蛋白質分子結構帶來整體或者局部的改變，蛋白質中的共價鍵對低于1 000～1 500 MPa的壓力幾乎都不敏感［9，12］。在沒有共價鍵形成或斷裂的情況下對蛋白質結構最具影響的就是水合作用。蛋白質分子可以通過氫鍵、靜電作用和疏水作用等形式與水分子結合。高壓使氫鍵變得更加穩定［15-16］，靜電作用在高壓下則被削弱［17］，疏水作用在高壓下同樣變弱［18-19］。各因素綜合作用的結果是蛋白質的水合作用得到了增強。高壓下維系蛋白質四級結構的靜電和疏水作用減弱，因此200 MPa左右的壓力可致蛋白的亞基解離，解離后的亞基仍有保持活性乃至發生構象轉變的可能，這是通過化學或者熱變性無法實現的［20］。高壓首先破壞的是維系三級結構的殘基間最弱的非共價鍵，然后是蛋白質-水之間的相互作用，接下來才是二級結構。高壓下變性的蛋白質和熱變性蛋白質其二級結構有很大的差異。對紅移型綠色熒光蛋白的研究發現，58℃、780 MPa處理后β-折疊減少而使蛋白結構有序程度降低，而熱變性的蛋白主要是發生不可逆的蛋白質的聚集［12，21］。不同的研究還表明，蛋白質的不同區域對壓力的敏感程度不同，β-螺旋比β-折疊敏感，側鏈和支鏈較主鏈更加敏感。對蛋白二硫鍵氧化還原酶的研究也表明，500 MPa以下壓力時β-螺旋對壓力更加敏感，而500 ～900 MPa時 β-折疊的損失更多［22］。Knudsen 等發現，β-乳球蛋白經300～450 MPa的處理后酶解生成的2種肽是蛋白質的D和G鏈水解的產物，這表明2條鏈在高壓下從β-乳球蛋白的桶狀結構中解離出來。另外，Cys66-Cys160附近酶切位點相關肽產物在未經高壓處理的蛋白水解產物中含量更高，這表明這些位點在高壓處理后被埋藏［23］。蛋白受高壓初期分子保持完整而水分子滲入其中而形成鼓脹而直至引發蛋白分子的去折疊［24-25］。Belloque等對β-乳球蛋白的研究發現，F、G和H鏈形成的結構區域更能耐受高壓，200 MPa處理下蛋白去折疊較400 MPa時更快，37℃去折疊較25℃更快，表明高壓對蛋白結構的影響與壓力、溫度和pH都有關。高壓下變性的蛋白在壓力釋放后可能恢復其天然狀態。但恢復情況與外界環境和處理壓力及時間有關［25］。相關的研究還發現，高壓能使變性的蛋白質重新折疊而恢復生物活性［26-29］。Wang等的研究發現，乙醇變性的大豆伴球蛋白經高壓后分子內氫鍵更加牢固，分子重排形成了有序的高級分子結構，在200～400 MPa壓力間分子的表面疏水性提高，高于500 MPa后表面疏水性降低;而乙醇變性的大豆球蛋白在高壓下去折疊，Tyr和Phe殘基暴露到分子表面;可見不同的蛋白質在高壓下可能有不同的變化，同種分子在不同的壓力范圍也會有不同的變化［26］。Dang等通過研究Cy3熒光染料標記的藻青蛋白經高壓后的熒光和熒光共振能量轉移行為發現，高壓處理后染料和藻青蛋白的距離變近，間接說明壓力可能使蛋白質分子的構造發生改變［30］。壓力可引起蛋白質的高級結構的變化，變化的情況與蛋白質本身和處理的條件都有關。因此，這樣的過程是可以也有必要根據實際需求進行選擇、調節和控制的過程。

2 高壓對蛋白質酶解的影響

高壓對蛋白質水解的影響主要表現在對水解速度、程度和水解產物的影響等方面。Knudsen等發現，β-乳球蛋白經150 MPa的處理其胰蛋白酶和糜蛋白酶的水解程度和水解產物都沒有變化，但是300～450 MPa的處理使蛋白水解速度提高了5～10倍，并且產物中肽的組成發生了變化［23］。對牛乳乳清蛋白經高壓處理后的研究表明，糜蛋白酶和胰蛋白酶在經100和200 MPa處理后具有高于300 MPa處理的水解程度，而胃蛋白酶僅能降解經高壓處理的蛋白，β-乳白蛋白不論經高壓處理與否都不能被糜蛋白酶降解。因此高壓處理對蛋白水解的影響不但與處理壓力有關而且與酶也有關［31］。Quiros等將卵清蛋白高壓處理后經糜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，對產物分析表明，雖然抗血管緊張素轉化酶(ACE)肽的含量并未提高，但是蛋白質水解程度和其他一些多肽的含量卻改變了，這可能與蛋白分子不同區域和片段對高壓的敏感程度不同有關，酶解增強的原因可能與蛋白結構改變帶來的更多酶切位點暴露、高壓影響酶的活性和高壓影響底物-酶的相互作用有關［32］。Belloque等對β-乳球蛋白的研究表明，只有高壓使蛋白的結構發生明顯變化時才促進蛋白水解［25］。Zeece等對β-乳球蛋白經高壓處理后模擬胃環境水解的研究表明，600～800 MPa的高壓處理10 min能使蛋白在1 min內完全水解解，并且水解得到的分子量低的小肽更多。這可能是降解速度太快，中等大小的肽來不及累積就已經被進一步降解［33］。Chicon等對乳清蛋白經高壓和胃蛋白酶、胰蛋白酶降解的研究發現，400 MPa、30 min的處理后酶解加速，高壓處理后的酶解生成更多中等大小的肽，而常壓酶解時中間產物增加慢，并且產生后很快被降解為更小的片段［34］。Zeece和Chicon得到中等大小肽的結果并不一致。卵清蛋白在400 MPa經不同時間的胃蛋白酶處理，均無完整的蛋白殘留，高壓處理顯著促進蛋白的水解，與常壓酶解相比水解初期出現較多的大分子疏水性肽，這和Chicon的研究結果一致。這可能與初期快速酶解中間產物大量累積有關，也可能與新酶切位點暴露而生成新的酶解產物有關［35］。對卵清蛋白經400 MPa處理和胃蛋白酶降解的研究發現，高壓處理后的酶解產物在產物的種類和數量上都和常壓酶解不同，因此高壓處理極可能改變了蛋白質的構造暴露了新的酶切位點［36］。Belloque等對β-乳球蛋白的研究還發現，高壓導致的蛋白質亞基解離、蛋白質分子膨脹帶來的酶切位點暴露、蛋白質柔性的增加都增加了酶和酶切位點的接近機會而促進酶解。如果酶解在高壓處理后進行，則需在蛋白質恢復其天然結構前進行［25］。目前的研究表明，高壓能促進蛋白質的酶解并且影響酶解產物種類，不同的酶、壓力、溫度、pH和處理時間所得到的結果都不相同。因此，探索高壓促進酶解的機理對于利用和控制高壓促進都有十分重要的意義。雖然高壓促進花生蛋白水解的研究鮮有報道，但是研究發現，熱變性的花生蛋白和天然花生蛋白在堿性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解時，其水解率雖無顯著差異而水解產物卻不同［35］。因此，高壓輔助的花生球蛋白酶解可能在產物、水解速度和程度上都和常壓酶解不同而值得關注。

3 高壓及高壓輔助酶解對蛋白質功能性質的影響

蛋白質的功能性質主要包括:與水合作用相關的性質，如吸水保水性、濕潤性、膨脹性、分散性和溶解性等;與蛋白質分子之間的相互作用有關的性質，如沉淀、膠凝作用、黏性等;與蛋白質的表面性質相關的如起泡、乳化與乳化穩定性等［3］。改善天然蛋白的功能性質以滿足不同食品的需求是植物蛋白質應用的關鍵問題。如上所述高壓能影響蛋白質的水合作用，蛋白質的分子結構和蛋白質的酶水解，因此高壓勢必對蛋白質的功能性質帶來直接或者間接的影響。Chicon等發現，乳清蛋白經400 MPa和胃蛋白酶、胰蛋白酶降解后其熱穩定性比天然蛋白和常壓下酶解產物都高;在低蛋白質濃度時400 MPa、10 min處理的酶解產物的乳化性有顯著提高，而400 MPa、30 min處理卻有最差的乳化性;蛋白溶解性在處理前后并沒有差異，乳化性的提高可能與高壓引起的分子柔性改變極性基團的分布和疏水殘基的暴露發生變化有關［34］。在pH 3.0時對大豆蛋白經200～600 MPa處理其溶解性提高而熱穩定性降低［37］。Wang等對乙醇變性的大豆蛋白的研究卻發現，200～300 MPa的壓力可以提高變性蛋白的溶解度，壓力升高溶解度因為蛋白質聚集而降低［26］。對大豆7S、11S和大豆分離蛋白的100～600 MPa處理表明，各種蛋白的溶解性改變與蛋白質、處理壓力和介質pH都有關系。7S蛋白在400 MPa處理后獲得最高的乳化性和表面疏水性而11S蛋白則在200 MPa處理后獲得最大值。大豆分離蛋白在400 MPa處理后達到最高乳化能力同時表面疏水性很低，可能是400 MPa下7S蛋白解離為部分或者完全變性的單體而是表面活性增加，而11S蛋白多肽鏈的解聚而產生聚集影響了分離蛋白的表面疏水性［38］。可見高壓對蛋白質功能性質的影響受多方面因素影響，并且不同功能性質的變化去勢常常不同，因此能根據需求生產不同的蛋白質改性產品是必要的也是可能的。

4 前景

高壓下蛋白質分子去折疊、疏水基團的暴露、分子柔性的改變和二硫鍵的破壞都帶來蛋白質構造的變化，這些變化不但影響蛋白質的功能性質，而且還通過影響蛋白質的酶解的進程和產物而影響改性蛋白的功能性質。改性過程受蛋白質種類、處理的條件和蛋白酶的種類等多因素的影響，使之成為一個復雜的，同時又是一個可以從多方面進行調節控制的，并且可能得到多樣化結果的過程，而調節和控制必須建立在掌握過程機理的基礎之上。因此，研究高壓處理過程中蛋白質的結構變化與蛋白質水解被促進間的聯系，采用不同的高壓和酶解條件處理以得到具有不同功能性質的改性蛋白質都具有較好的研究前景。

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