響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取狀元豆多糖工藝*

黎英，尤雙圳，賴丹妮，陳雪梅，石小瓊

(龍巖學院，福建龍巖，364012)

狀元豆學名萊豆，是閩西地區(qū)種植歷史悠久的一年蔓性大萊豆品種［1］，其具有喜溫怕冷的生長習性，適宜海拔600米以上廣東和福建地區(qū)種植［2］，在民間常作為利尿化濕、健脾的保健蔬菜食用，具有祛濕、補血、健胃、強腎、養(yǎng)顏防衰、抑制癌細胞、通便、防止骨質(zhì)疏松老等功效［3-4］。

多糖是一類具有多種生物活性功能的高分子化合物，在臨床上對腫瘤、肝炎、心臟病、神經(jīng)衰弱均有一定療效［5］。近年來的研究也證明，多糖除具有抗氧化、抗病毒、抗輻射、抗腫瘤、抗疲勞及調(diào)節(jié)免疫細胞等生物活性外，還具有抗凝血、抗血栓、降血糖、降血脂、延緩衰老等特性，甚至對艾滋病病毒也有一定的防御功能［6-7］。

目前國內(nèi)外關(guān)于多糖的提取研究報道較多，但鮮見對狀元豆多糖的提取工藝研究的報道。本研究在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，用超聲波技術(shù)輔助提取狀元豆多糖，再通過響應(yīng)面分析法對工藝條件進行優(yōu)化。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

狀元豆，由龍巖上杭農(nóng)科所提供;葡萄糖標準品，Sigma化學公司;石油醚、葡萄糖、無水乙醇、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、H2SO4、苯酚等。均為分析純，上海國藥集團。

1.2 儀器與設(shè)備

FZ102型微型植物粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;RE52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;FD-1-50型真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;SK8210LHC型超聲波清洗機，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司;TB-114型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;DHG-9140A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;SHB-3型循環(huán)水多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠;TGL-16G-A型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠;UV-2102C型紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司。

2 實驗方法 ［8-12］

2.1 狀元豆多糖的超聲波提取

將干燥過的狀元豆粉碎過40目篩，用濾紙包成圓柱形，加入3倍體積的石油醚，用索氏抽提裝置80℃回流脫脂4 h，再用3倍體積分數(shù)為95%乙醇回流2次，2 h/次，除去生物堿、低聚糖、揮發(fā)油等小分子物質(zhì)。冷凍干燥后備用。稱取5.0 g預(yù)處理過的狀元豆粉，加蒸餾水浸制后，懸浮液按試驗設(shè)定的條件進行超聲波提取，將提取液離心(3 000 r/min，15 min)，沉淀物按照同樣的提取條件重復(fù)提取2次，合并上清液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。向濃縮液加入Sevag試劑振蕩去蛋白后加入4倍體積的95%乙醇，放入4℃冷藏柜中靜置，12 h后離心(4 000 r/min，10 min)得沉淀，再依次用乙醇、丙酮反復(fù)振動洗滌3次，最后真空冷凍干燥，即得狀元豆多糖粗提物。

2.2 狀元豆多糖提取率的測定

2.2.1 葡萄糖標準曲線的制備

精確稱取葡萄糖(經(jīng)105℃干燥至質(zhì)量恒定)標準樣品10.00 mg，用蒸餾水溶解并定溶于100 mL容量瓶，配制成質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的葡萄糖標準溶液。依次吸取 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL葡萄糖標準液，于100 mL容量瓶中并加蒸餾水定容搖勻備用。然后精確移取上述各溶液2 mL置于具塞刻度試管中，各加入體積分數(shù)5%苯酚溶液1.0 mL和濃H2SO45 mL，充分混勻，室溫靜置30 min，于490 nm波長處測定吸光度。以0號管為空白對照，以吸光度為橫坐標，葡萄糖質(zhì)量濃度為縱坐標繪制標準曲線。

2.2.2 精密度實驗

分別移取6份同一狀元豆多糖供試樣品溶液各2.0 mL，置于具塞試管中，按2.2.1方法操作測定吸光度，重復(fù)6次。

2.2.3 穩(wěn)定性實驗

精密移取2.0 mL狀元豆多糖供試樣品溶液按2.2.1 方法操作，分別在 10、30、60、90、120、150、180 min時測定溶液吸光度。

2.2.4 重復(fù)性實驗

分別移取在同一提取條件下，重復(fù)實驗操作6次獲得的狀元豆多糖供試樣品溶液各2.0 mL共6份，置于具塞試管中，按2.2.1方法操作測定吸光度，計算多糖含量。

2.2.5 加標回收實驗

精密移取2.0 mL狀元豆多糖供試樣品溶液5份，分別加入不同體積的0.010 mg/mL的葡萄糖標準溶液，按2.2.1方法操作測定吸光度，按以下公式計算加標回收率。

2.2.6 狀元豆多糖提取率計算

將狀元豆粗多糖溶解并稀釋至適當質(zhì)量濃度，移取2.0 mL狀元豆粗多糖樣品液按2.2.1方法操作，于490 nm處測定其吸光度，重復(fù)3次，取平均值。按以下公式計算多糖提取率。

式中:c為提取的樣品液多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL;V0為樣品液的總體積，mL;n為稀釋倍數(shù);V為樣品測定液的體積，mL;m為稱取的預(yù)處理狀元豆粉的質(zhì)量，g。

2.3 狀元豆多糖提取單因素實驗

用蒸餾水作溶劑進行提取，分別考察液固比、超聲功率、超聲時間及提取溫度4個試驗因素對狀元豆多糖提取率的影響程度，進行單因素實驗。

2.3.1 液固比對狀元豆多糖提取率的影響

稱取預(yù)處理過的狀元豆粉5.0 g，按液固10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL∶g)的比例加入蒸餾水，在溫度50℃，功率200 W條件下超聲處理30 min，按2.1、2.2.1及2.2.6實驗方法提取粗多糖、測定提取液吸光度并計算多糖提取率，繪制曲線。

2.3.2 超聲功率對狀元豆多糖提取率的影響

稱取預(yù)處理過的狀元豆粉5.0 g，選取2.3.1獲得的最適液固比加入蒸餾水，在溫度50℃條件下，分別在超聲功率 200、250、300、350、400 W 條件下處理30 min，按2.1、2.2.1及2.2.6實驗方法提取粗多糖、測定提取液吸光度并計算多糖提取率，繪制曲線。

2.3.3 超聲時間對狀元豆多糖提取率的影響

稱取預(yù)處理過的狀元豆粉5.0 g，選取2.3.1和2.3.2獲得的最佳液固比和功率，在溫度50℃條件下，分別超聲處理 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，按 2.1、2.2.1及2.2.6實驗方法提取粗多糖、測定提取液吸光度并計算多糖提取率，繪制曲線。

2.3.4 提取溫度對狀元豆多糖提取率的影響

稱取預(yù)處理過的狀元豆粉5.0 g，選取2.3.1～2.3.3獲得的最佳液固比、功率和時間，依次以20、30、40、50、60 ℃ 為提取溫度，按 2.1、2.2.1 及 2.2.6實驗方法提取粗多糖、測定提取液吸光度并計算多糖提取率，繪制曲線。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗確定的提取條件下，以液固比、超聲功率、超聲時間、提取溫度4個試驗因素為考察因素，以狀元豆多糖提取率為考察指標，稱取3份預(yù)處理過的狀元豆粉各5.0 g，做3次平行實驗，按2.1、2.2.1及2.2.6實驗方法提取粗多糖、測定提取液吸光度并計算多糖提取率，再采用Minitab15軟件中Box-Behnken試驗設(shè)計原理，建立數(shù)學回歸模型，進行數(shù)據(jù)分析，其因素水平設(shè)計見表1。

表1 狀元豆多糖提取率的Box-Behnken因素與水平編碼Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design on the extraction yield of beans champion polysaccharides

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線的繪制

根據(jù)標準葡萄糖濃度c及對應(yīng)的吸光度值A(chǔ)的關(guān)系，得到苯酚-硫酸法測定多糖濃度的標準曲線方程:C=0.133 39A-0.000 7，相關(guān)系數(shù)R=0.999 6，在0.02～0.14 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

3.2 精密度實驗結(jié)果

由表2可知，供試狀元豆多糖樣品的RSD為2.834%，表明用硫酸-苯酚法測定狀元豆多糖含量精密度較高。

表2 精密度實驗結(jié)果Table 2 The results of Precision test

3.3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

由表3可看出，供試狀元豆多糖樣品溶液的吸光度在120 min內(nèi)每隔30 min保持穩(wěn)定，在150 min后開始下降，說明樣品提取液按測定標準曲線的方法，在30 min左右時間測定的吸光度穩(wěn)定好，能達到一般分光光度計的要求。

表3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 3 The results of Stability test

3.4 重復(fù)性實驗結(jié)果

由表4可知，供試樣品狀元豆多糖的含量平均為0.047 59 mg/mL，相對偏差為1.368%，說明該方法測定狀元豆多糖含量的重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性實驗結(jié)果Table 4 The results of Repeatability test

3.5 加標回收率實驗結(jié)果

由表5結(jié)果可知，供試狀元豆多糖樣品加標后回收率在95.97%～102.47%，平均回收率為99.64%，相對標準偏差為2.87%，說明該方法加標回收率高，準確度好。

表5 加標回收率實驗結(jié)果Table 5 The results of recovery rate test

3.6 狀元豆多糖提取工藝參數(shù)單因素試驗結(jié)果分析

3.6.1 液固比對狀元豆多糖提取率的影響

由圖2可知，液固比為10∶1(mL∶g)時的狀元豆多糖提取率并不高，但隨著溶劑量的增大，提取率相應(yīng)地增大，而當液固比超過30∶1后稍略有下降。可能是當溶劑量少，物料黏度大，擴散速度慢，提取不完全;但溶劑量過多可能導(dǎo)致溶劑對超聲波有一定的吸收而使超聲波破碎細胞程度下降，降低多糖的溶出量。并且考慮到增加水量不利于后期蒸發(fā)濃縮，在保證提取效果的同時，應(yīng)盡量減少水用量和降低蒸發(fā)濃縮的負荷。因此液固比選在20∶1～40∶1(mL∶g)比較合適。

圖2 液固比對狀元豆多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ratio liquid to solid on the extraction yield of polysaccharides from beans champion

3.6.2 超聲功率對狀元豆多糖提取率的影響

從圖3可以看出，狀元豆多糖提取率在超聲功率300W時達到最大值，而后隨著超聲波功率的增大，多糖提取率反而有下降趨勢。可能是因為超聲波的功率與其作用有一定關(guān)系，一般功率越高，空化越強烈，可快速有效地促進植物細胞破壁破裂，加速提取溶劑對狀元豆細胞內(nèi)多糖的滲透，但功率如果過高，反而會相應(yīng)產(chǎn)生大量無用的氣泡，同時增加散射衰減，并形成聲屏障，并且過高的功率易引起局部溶液瞬間升溫，造成部分多糖分子結(jié)構(gòu)的斷裂，導(dǎo)致提取率降低。因此，確定超聲功率250～350W為最佳試驗條件。

圖3 超聲功率對狀元豆多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides from beans champion

3.6.3 超聲時間對狀元豆多糖提取率的影響

由圖4可知，在2～3 h內(nèi)隨著超聲時間的延長，狀元豆多糖提取率增加明顯，呈正相關(guān);時間超過3h后提取率變化不明顯，并且有所下降。可能時間小于2 h時，狀元豆中的多糖還沒有完全被浸提處理，而3 h后，多糖可能已經(jīng)達到最大溶解狀態(tài)，同時可能因為部分多糖在長時間的超聲波機械剪切力作用下被降解或某些熱敏性多糖類成分因發(fā)生長時間高頻運動下而被熱降解成小分子而造成損失。同時從節(jié)省能源角度考慮，提取時間也不能過長。因此綜合考慮2～3 h超聲時間較適宜。

圖4 超聲時間對狀元豆多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharides from beans champion

3.6.4 提取溫度對狀元豆多糖提取率的影響

從圖5可以看出，溫度對提取狀元豆多糖的影響較大，溫度越高，狀元豆多糖提取率越高。這可能是因為溫度升高，狀元豆顆粒逐漸軟化和變形，而溶劑分子因熱效應(yīng)加速進入狀元豆顆粒的內(nèi)部，使多糖的滲透力和溶解力加強，進而使多糖從細胞中更容易轉(zhuǎn)移到水溶劑中。但因需同時考慮提取溫度60℃是超聲波清洗器的最高工作溫度，如果長時間使用會對超聲波器儀造成一定的損壞。所以提取溫度選擇50℃左右比較合適。

圖5 提取溫度對狀元豆多糖提取率的影響Fig.5 Effect of extracting temperature on the extraction yield of polysaccharides from beans champion

3.7 狀元豆多糖提取工藝參數(shù)優(yōu)化

3.7.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗確定的最佳水平基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken軟件中心組合設(shè)計原理，設(shè)計4因素3水平共29個試驗，其中24個分析因子試驗，5個零點試驗。優(yōu)化超聲波輔助提取狀元豆多糖的工藝條件。設(shè)計的試驗方案和結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken中心試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 6 Box-Behnkenl central composite design arrangement and experimentral results

3.7.2 回歸模型的建立和方差分析

使用響應(yīng)面分析法對表6中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，可得到液固比、超聲功率、超聲時間、提取溫度相關(guān)回歸系數(shù)，其回歸方程為:

Y=-55.809 75+0.362 6A+0.128 88B+11.676 67C+0.875 67D+4.100 00E-004AB+0.027 000AC-3.20 000E-003AD-1.300 00E-003BC+1.050 00E-005BD-0.039 500CD-6.357 50E-003A2-2.293 00E-004B2-1.953 00C2-7.082 50E-003D2

進一步對回歸方程進行分析，所得的方差分析見表7。

表7 狀元豆多糖提取率的回歸方程各項的方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation on the extraction yield of beans champion polysaccharides

由表7可知，回歸二次方程模型的P＜0.000 1(極顯著)，而失擬項P=0.999 4＞0.05(不顯著)，說明正交試驗結(jié)果與數(shù)學模型擬合程度良好，可用模型來分析和預(yù)測狀元豆多糖的提取工藝條件。決定系數(shù)R2=0.970 8，與校正決定系數(shù)Adj.R2=0.941 6相近，表明狀元豆多糖提取率預(yù)測值與實測值有較好的擬合度。次變異系數(shù)CV=2.25%，也說明模型的置信度較高，試驗的可靠性和精確度較好。同時，由表7的F值大小可知，4個因素對狀元豆多糖提取率影響顯著程度排序為:超聲功率＞超聲時間＞液固比＞提取溫度;且各因素交互作用對狀元豆多糖提取率的影響強弱依次為:AD＞AB＞CD＞AC＞BD＞BC;二次項中4個因素對狀元豆多糖提取率的影響都達到極顯著水平。

3.7.3 兩因素交互作用分析

4個因素兩兩交互作用的三維響應(yīng)面圖，如圖6所示。

圖6 各因素對多糖提取率影響的等高線及響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of effect of interactions between every two factors on the extraction yield of beans champion polysaccharides

依據(jù)響應(yīng)面的等高線的形狀越接近橢圓形和曲面傾斜度越陡，響應(yīng)值對于處理條件改變的敏感程度越大，因素間交互作用越顯著，反之則交互作用不顯著。由圖6可看出，4個因素對多糖提取率的影響都呈先增大后減的趨勢。液固比和提取溫度，以及液固比和超聲功率的交互作用極顯著;超聲時間和提取溫度交互作用顯著;而液固比和超聲時間、超聲功率和提取溫度以及超聲功率和超聲時間沒有顯著地交互作用。

3.7.4 最佳工藝參數(shù)的選取

由Box-Behnken軟件計算出狀元豆多糖提取的最佳工藝條件為:液固比38.85∶1(mL∶g)，超聲功率319.18 W，超聲時間2.67 h，提取溫度47.98℃，在此參數(shù)下預(yù)測的總多糖提取率6.78%。考慮實際條件的可操作性，將條件適當調(diào)整為液固比39∶1(mL∶g)，超聲功率319 W，超聲時間2.7 h，提取溫度48℃，在此條件下進行3次驗證性試驗，狀元豆多糖提取率平均為6.74%，與預(yù)測值的相對誤差為0.59%，差異不明顯。因此，利用響應(yīng)面法優(yōu)化出的提取工藝參數(shù)基本準確可靠。

4 結(jié)論

(1)通過對顯色的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加標回收率的考察，結(jié)果表明，利用硫酸-苯酚分光度計法測定分析狀元豆多糖含量的方法快速、準確、簡單、靈敏、重復(fù)性好，可操作性強，可用于狀元豆多糖含量的測定。

(2)狀元豆多糖最佳提取條件為:液固比39∶1(mL∶g)，超聲功率319 W，超聲時間2.7 h，提取溫度48℃，通過3次驗證試驗，在此條件下狀元豆多糖提取率平均為6.74%，與預(yù)測值的相對誤差為0.59%，差異不顯著。

(3)4個因素對狀元豆多糖提取率影響的程度排序為:超聲功率＞超聲時間＞液固比＞提取溫度。

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