不同提取方法對山藥多糖含量及其體外抗氧化活性的影響*

高行恩，王洪新

1(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院酒店與旅游管理學(xué)院，江蘇淮安，223003)

2(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)3(江南大學(xué)國家功能食品工程技術(shù)中心，江蘇無錫，214122)

山藥是薯蕷屬植物薯蕷(Dioscorea opposita Thunb.)的塊莖，含有多糖［1］、皂苷［2］、多酚［3］等多種生物活性物質(zhì)。其中，山藥多糖是山藥的主要功能性成分［2］。研究表明，山藥多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)脾胃、修復(fù)腎小管、免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性［4-6］。植物多糖的傳統(tǒng)提取方法為水提法。近年來，隨著新興提取技術(shù)的快速發(fā)展，超聲波輔助法［7-8］、酶法［9-12］、微波輔助法［13-14］等在山藥多糖的提取中得到了應(yīng)用。植物多糖組分復(fù)雜，采用不同提取方法可能會引起得率、組分及生物活性的變化［15-16］。然而，新興提取技術(shù)對山藥多糖生物活性的影響，罕有報道。此外，山藥多糖因產(chǎn)地［17］、品種［18］、生長期［19］、測定方法不同而導(dǎo)致其含量差異較大。本文以江蘇淮安10月份所產(chǎn)淮山藥為研究對象，考察不同提取方法對山藥多糖含量及其體外抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淮山藥，江蘇淮安10月份產(chǎn);無水乙醇、無水甲醇、丙酮、正丁醇、三氯甲烷、苯酚、濃H2SO4、三氯乙酸、H2O2、鄰二氮菲、三羥基甲基氨基甲烷、葡萄糖、H3PO4、K4Fe(CN)6、FeSO4、鄰苯三酚，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)分析純，購自美國Sigma公司;纖維素酶(500U/mg)、果膠酶(100U/mg)、酸性蛋白酶(800U/mg)，均為食品級，購自江蘇銳陽生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗儀器

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州榮冠實驗分析儀器廠;WFZ UV-2100紫外可見分光光度計，優(yōu)尼科(上海)儀器有限公司;GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;AVM 602/WH微波爐，PHILIPS、SEIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;YQ-9200超聲波清洗機(jī)，上海易凈超聲波儀器有限公司、DL-5-B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料處理

新鮮山藥洗凈，去皮，切片(3 mm厚)，冷凍干燥，粉碎過60目篩，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇回流脫脂，揮干溶劑，備用。

1.3.2 提取方法

水提法［20-21］:準(zhǔn)確稱取山藥干粉20 g，按不同的料液比，恒溫水浴60～180 min，提取2次，合并提取液。超聲法［22］:準(zhǔn)確稱取山藥干粉20 g，按一定料液比，在恒溫水浴中超聲提取30～180 min，提取2次，合并提取液。微波法［15］:準(zhǔn)確稱取山藥干粉20 g，按一定料液比，微波處理5～35 min，提取2次，合并提取液。酶法［14］:準(zhǔn)確稱取山藥干粉20 g，按照不同加酶量，加入由纖維素酶、果膠酶、蛋白酶(質(zhì)量比1∶1∶1)配成的復(fù)合酶，在最適pH條件下，恒溫酶解30～150 min，90℃將酶滅活，提取2次，合并提取液。

1.3.3 多糖的制備

將提取液真空濃縮至100 mL，離心除去雜質(zhì)，Sevag法除去蛋白［23］，蒸餾水中透析12 h，于透析液中加入4倍體積的無水乙醇，4℃靜置12 h。抽濾，分別用100 mL的無水甲醇和丙酮洗滌殘渣各2次，揮發(fā)干溶劑，真空冷凍干燥，可得粗多糖，稱重備用。

1.3.4 山藥多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法［24］，精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖100 mg，用蒸餾水定容至1 000 mL。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于10 mL具塞試管內(nèi)，補(bǔ)充蒸餾水至2.0 mL，另取1支具塞試管加入2.0 mL蒸餾水作為對照。每只試管精密加入濃度6 mg/mL的苯酚溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)1.0 mL、濃 H2SO45.0 mL，混勻，放置10 min，后搖勻，再次放置20 min，在490 nm處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量X為橫坐標(biāo)，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=9.638 6X，R2={0.999 9。}線性范圍:10～200 μg。

稱取10 mg山藥粗多糖溶于水，定容至100 mL。將待測液每份精密移取1.0 mL，置10 mL具塞試管內(nèi)，加入蒸餾水1.0 mL，按以上操作，測定吸光度(每份樣品做3個平行，取平均值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中葡萄糖含量，再乘以系數(shù)0.9換算為多糖含量。山藥多糖得率計算公式:

1.3.5 正交優(yōu)化多糖提取工藝

以單因素試驗為基礎(chǔ)，設(shè)計正交優(yōu)化試驗。水提法以料液比、提取溫度、提取時

間為考察因素，設(shè)計L9(33)正交試驗。超聲法以料液比、超聲功率、提取溫度、提取

時間為考察因素，設(shè)計L9(34)正交試驗。微波法以料液比、微波功率、提取時間為考

察因素，設(shè)計L9(33)正交試驗。酶法以料液比、加酶量、提取溫度、提取時間為考察

因素，設(shè)計L9(34)正交試驗。

表1 水提法正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal testwith hot water extraction method

表2 超聲法正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal test with ultrasonic extraction method

表3 微波法正交試驗因素水平表Table 3 Factors and levels table of orthogonal testwith microwave extraction method

表4 酶法正交試驗因素水平表Table 4 Factors and levels table of orthogonal test with enzymatic extraction method

1.3.6 粗多糖中雜質(zhì)的檢測

通過紫外掃描檢測260～280 nm波長內(nèi)是否有吸收峰來判斷粗多糖中是否含有蛋白質(zhì)、多肽、核酸等。通過Folin-Ciocalteu(FC)法測定粗多糖中的總酚含量［25-26］。

1.3.7 體外抗氧化能力測定

還原力測定［27］:將2 mL H3PO4緩沖液(pH值為6.6)、2 mL K4Fe(CN)6溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)和1 mL山藥粗多糖溶液(濃度 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)加入具塞比色管中，充分振蕩混勻后50℃水浴20 min，迅速冷卻。加入2.5 mL三氯乙酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)，混勻后3 000 r/min離心20 min，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水和 FeCl3各2.5 mL，混勻，靜置10 min。在700 nm波長處測定吸光度。3次平行，取平均值。

DPPH·清除能力測定［28］:將2 mL山藥粗多糖溶液與2 mL DPPH(0.1 mol/mL，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇)充分混勻后，避光靜置20 min，在517 nm波長處測吸光度Ai。將2 mL山藥粗多糖溶液與2 mL 95%的乙醇混勻后測吸光度Aj，將2 mL蒸餾水與2 mL DPPH溶液混勻后測吸光度Ac。3次平行，取平均值。按下述公式計算清除率:

·OH清除能力測定［29］:將1 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)、1 mL鄰二氮菲溶液(2.5×10-3mol/L)、1 mL FeSO4溶液(2.5×10-3mol/L)、1 mL山藥多糖水溶液(濃度 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)、0.5 mL 雙氧水(0.02 mol/L)，混勻后，37 ℃ 水浴60 min，在536 nm波長處測定吸光度Ai。以1 mL蒸餾水取代多糖水溶液，重復(fù)上述操作，吸光度為Aj。以1.5 mL蒸餾水取代多糖水溶液和雙氧水溶液，重復(fù)上述操作，吸光度為Ac。3次平行，取平均值。按下述公式計算清除率:

O2-· 清除能力測定［8］:將 6 mL Tris-HCl(pH=8.2)緩沖溶液和1 mL山藥粗多糖溶液(濃度0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL)加入試管中混勻，37℃ 水浴20 min，再加1 mL鄰苯三酚鹽酸溶液(7 mmol/L，37℃預(yù)熱)，充分混勻后，反應(yīng)4 min，然后加入濃HCl終止反應(yīng)。在325 nm波長處測定吸光度Ai。以1 mL蒸餾水代替樣品液，重復(fù)上述操作，測定吸光度Aj。按下述公式計算清除率:

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析預(yù)處理，采用S-N-K9(S)法對不同提取方法對多糖得率的影響進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法對山藥多糖含量的影響

2.1.1 水提法

單因素確定山藥多糖適宜的提取條件為:料液比1∶20(g∶mL)、溫度 80 ℃、提取 150 min。以此為基礎(chǔ)，以多糖得率為評價指標(biāo)，所得正交試驗結(jié)果如表5所示。由表5極差分析可知，水提法中影響山藥多糖提取的3個因素，其主次順序為:時間＞溫度＞料液比。結(jié)合不同因素的K值比較，優(yōu)化工藝為A2B2C3，即料液比 1∶20、提取溫度 80℃、提取時間 180 min。

表5 水提法提取山藥多糖正交實驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Orthogonal experimental design and results of extracting Chinese yam polysaccharideswith hot water extraction method

2.1.2 超聲法

單因素確定山藥多糖適宜的提取條件為:料液比1∶20、微波功率400 W、溫度70℃、提取120 min。以此為基礎(chǔ)，以多糖得率為評價指標(biāo)，所得正交試驗結(jié)果如表6所示。

表6 超聲法提取山藥多糖正交實驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental design and results of extracting Chinese yam polysaccharideswith ultrasonic extraction method

由表6極差分析可知，超聲法中影響山藥多糖提取的4個因素，其主次順序為:提取時間＞超聲功率＞提取溫度＞料液比。結(jié)合不同因素的K值比較，優(yōu)化工藝為A2B2C3D1，即料液比1∶20、超聲功率400 W、提取溫度80℃、提取時間90 min。

2.1.3 微波法

單因素確定山藥多糖適宜的提取條件為:料液比1∶20、微波功率550 W、提取20 min。以此為基礎(chǔ)，以多糖得率為評價指標(biāo)，所得正交試驗結(jié)果如表7所示。由表7極差分析可知，微波法中影響山藥多糖提取的3個因素，其主次順序為:提取時間＞微波功率＞料液比。結(jié)合不同因素的K值比較，優(yōu)化工藝為A2B2C3，即料液比1∶20、微波功率550 W、提取時間25 min。

表7 微波法提取山藥多糖正交實驗設(shè)計與結(jié)果Table 7 Orthogonal experimental design and results of extracting Chinese yam polysaccharideswith microwave extraction method

2.1.4 酶法

單因素確定山藥多糖的適宜提取條件為，料液比1∶20、加酶量0.45%、溫度50℃、提取60 min。以此為基礎(chǔ)，以多糖得率為評價指標(biāo)，所得正交試驗結(jié)果如表8所示。由表8極差分析可知，酶法中影響山藥多糖提取的4個因素，其主次順序為:料液比＞加酶量＞溫度＞提取時間。結(jié)合不同因素的K值比較，優(yōu)化工藝為A2B3C2D2。然而該最佳工藝并未出現(xiàn)在正交表中，因此需要進(jìn)行驗證實驗。通過實驗發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)工藝得率為9.65%，高于正交表中的最高得率9.43%。因此，可以確定酶法提取山藥多糖的最佳工藝為:料液比1∶20、加酶量0.55%、溫度50℃、提取時間60 min。

表8 酶法提取山藥多糖正交實驗設(shè)計與結(jié)果Table 8 Orthogonal experimental design and results of extracting Chinese yam polysaccharideswith enzymatic extraction method

2.1.5 不同提取方法所得山藥多糖含量的比較

4種不同提取方法在上述最優(yōu)條件下，分別提取3次，取平均值。不同提取方法所得山藥多糖含量對比如表9所示。

表9 不同提取方法對山藥多糖含量的影響(n=3)Table 9 Effects of extract methods on the yields of Dioscorea opposita polysaccharides(n=3)

由表9可知，酶法、微波法、超聲法均顯著提高了山藥多糖得率(P＜0.05)，縮短了提取時間。酶法效果最好，多糖得率提高27.48%，耗時僅為水提法的1/3。這是因為植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素、半纖維素和果膠，纖維素酶和果膠酶促進(jìn)了細(xì)胞壁的破裂，有利于多糖從細(xì)胞中釋放［14］。山藥中有大量多糖以糖蛋白的形式存在［30］，蛋白酶將蛋白水解，有助于多糖的溶出。微波則使原料內(nèi)部的水分等極性物質(zhì)迅速吸收能量而大量產(chǎn)熱，液態(tài)水氣化而產(chǎn)生壓力致使細(xì)胞破裂，形成微小的孔洞，有利于多糖成分的迅速溶出［15-16］。超聲波的空化作用、熱效應(yīng)、機(jī)械作用可以加速細(xì)胞壁的破碎，從而加快多糖釋放，節(jié)省提取時間［9］。與超聲和微波提取法相比，酶法提取條件溫和，避免多糖因為劇烈震動而導(dǎo)致的降解，有利于多糖結(jié)構(gòu)的保持。與水提法相比，酶法提取使得多糖的釋放和溶解相對迅速和徹底。此外，在該實驗中，經(jīng)過酶法提取，蛋白質(zhì)被水解，解決了山藥粗多糖中存在大量結(jié)合蛋白的問題，省去了多糖脫蛋白的環(huán)節(jié)，減少了實驗步驟，減少甚至避免了三氯甲烷的使用，更為安全、環(huán)保。

2.2 山藥多糖中雜質(zhì)成分的含量

多糖在提取中容易混雜蛋白、酚類等雜質(zhì)，從而影響實驗結(jié)果。Sevag法8次除蛋白后，經(jīng)過紫外掃描，在260 nm和280 nm處無吸收峰，說明樣品中不含蛋白質(zhì)類雜質(zhì)。福林試劑檢測為陰性，說明無酚類雜質(zhì)。

2.3 不同提取方法對山藥多糖體外抗氧化活性的影響

2.3.1 不同提取方法對山藥多糖還原力效果的影響

抗氧化劑通過還原作用提供電子而清除自由基。在此評價方法中，還原力越強(qiáng)，其抗氧化效果越好。通過測定700 nm處還原產(chǎn)物的吸光度，能夠判斷還原能力，進(jìn)而反應(yīng)其抗氧化能力。由圖1可知，不同提取方法所得的山藥多糖都具有一定的還原力，且隨濃度增大而升高，最終達(dá)到最大還原力。酶法和微波法效果較好，在多糖濃度2.0 mg/mL時，吸光度分別可達(dá)1.8、1.45;水提和超聲法較弱，在多糖濃度2.0 mg/mL時，吸光度僅為1.0和0.9。

圖1 不同提取方法所得山藥多糖的還原力Fig.1 The reducing power of Dioscorea opposita polysaccharides

2.3.2 不同提取方法對山藥多糖DPPH·清除能力效果的影響

抗氧化劑提供電子與DPPH自由基的孤對電子配對，DPPH由深紫色的自由基形式被還原成黃色的非自由基形式，所接受的電子數(shù)量與其褪色程度成定量關(guān)系，因而可以通過吸光度的變化進(jìn)行定量分析［31-32］。由圖2可知，隨著濃度的增大，不同提取方法所得山藥多糖的清除DPPH自由基能力均呈上升趨勢且逐漸接近。酶法提取的多糖在濃度為0.5 mg/mL時自由基清除能力可達(dá)91%。濃度為1.0 mg/mL時，微波法清除能力為78%、酶法為68%、水提法為51%。

圖2 不同提取方法所得山藥多糖的DPPH·清除能力Fig.2 Scavenging effect of Dioscorea opposita polysaccharides on DPPH radicals

2.3.3 不同提取方法對山藥多糖·OH清除能力效果的影響

多糖分子末端的半縮醛羥基具有還原性，可將自由基還原，從而阻止自由基連鎖反應(yīng)。由圖3可知，酶法提取的多糖清除羥基自由基能力最強(qiáng)，微波法和水提法相近，超聲法最弱。在濃度為2.0 mg/mL時，酶法提取的多糖對羥基自由基的清除率為98%，微波法為75%，水提法為65%，超聲法為54%。

圖3 不同提取方法所得山藥多糖的·OH清除能力Fig.3 Scavenging effect of Dioscorea opposita polysaccharides on hydroxyl radicals

2.3.4 不同提取方法對山藥多糖O2-·清除能力效果的影響

由圖4可知，O2-·清除能力隨多糖濃度提高而上升以至最大值。不同濃度時，4種提取方法所得多糖清除O2-·的能力有所不同。多糖濃度0.25mg/mL時，水提法和超聲法清除O2-·能力接近，清除率分別為31%、27%;微波法和酶法效果相當(dāng)，清除率分別為50%、49%。多糖濃度1.0 mg/mL時，酶法效果最好，其次為微波法和水提法，最后為超聲法。而多糖濃度高于2.0 mg/mL時，微波法效果最好;多糖濃度為4.0 mg/mL時，酶法和水提法效果相當(dāng)。

圖4 不同提取方法所得山藥多糖的O2-·清除能力Fig.4 Scavenging effect of Dioscorea opposita polysaccharides on superoxide radicals

3 結(jié)論

本文以江蘇淮安10月份所產(chǎn)同一批次的淮山藥為實驗原料，采用水提法、超聲法、微波法、酶法4種提取方法制備了山藥多糖，并就其含量和抗氧化能力進(jìn)行了測定和比較。確定了提取山藥多糖得率最高的方法為酶法，且該方法大大縮短了提取時間，節(jié)省了實驗步驟，更為安全、環(huán)保。通過對體外抗氧化能力的四種評價指標(biāo)進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)不同提取方法所制得的山藥多糖均具有較好的體外抗氧化活性。就其總還原力、DPPH·清除能力、·OH清除能力而言，酶法制備的多糖抗氧化能力最好，其余依次為微波法、水提法、超聲法。這是因為，多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，如分子質(zhì)量、化學(xué)組成、糖苷鍵、分支度、立體構(gòu)象等［33］。酶法提取條件較為溫和，可能較好地保持了多糖分子的結(jié)構(gòu)，有利于其抗氧化活性的保持。而其他方法所制得的多糖抗氧化活性的損失則可能會破壞多糖分子結(jié)構(gòu)。但其O2-·自由基清除能力，微波法＞酶法＞水提法＞超聲法。總體而言，酶法輔助提取所制備的山藥多糖得率高、抗氧化活性強(qiáng)，便于深入研究。然而，不同提取方法對山藥多糖結(jié)構(gòu)的影響及其與抗氧化活性之間的關(guān)系，尚待進(jìn)一步研究。

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