雙水相萃取技術在提取純化生物制品中的應用*

范勇，盧艷敏，崔波

(齊魯工業大學食品科學與工程學院，山東 濟南，250353)

雙水相(aqueous two phase systems，ATPS)即2種不相溶的聚合物溶液或聚合物溶液與鹽相互混合達到一定臨界濃度時，形成互不相溶的兩相。雙水相系統主要有以下幾種類型:聚合物-聚合物，聚合物-鹽，離子液體-鹽，小分子醇-鹽和2種表面活性劑［1］。1956年，Albertsson等測定了多種雙水相的相圖及研究多種生物制品(如蛋白質、核酸、病毒、細胞及細胞顆粒)在雙水相中的分配行為。其研究表明，ATPS法提取生物制品蘊含巨大的應用價值［2］。ATPS技術主要優勢:ATPS含水量達70%～90%，能提供溫和的提取條件和環境，適于提取不穩定的生物粒子;界面張力低，可提高傳質速度;ATPS技術可連續化，集成化生產，減少單元操作過程。此外，ATPS技術優勢還包括自然分相時間短，易于擴大化生產，分配系數可控。ATPS已被廣泛應用于多種生物制品的提取純化［3-4］。

1 雙水相法提取生物制品

ATPS提取生物制品可歸納為以下幾個方面:(1)提取蛋白質、酶，ATPS提取蛋白質的優勢在于大大降低了破壞蛋白質結構的可能性，保留其原有的活性;(2)提取遺傳物質DNA;(3)提取具有高附加值的小分子物質;(4)提取細胞及細胞器。物質的表面性質、電荷作用、與疏水鍵的相互作用使目標物與雜質在上下相分配系數不同，可將目標物與雜質分離，如通過物質的表面性質(疏水性、親水性)將目標物與雜質(表面性質與目標物相反)分離。目前研究較多的是ATPS萃取目標物的實驗工藝條件，影響目標物分配行為包括多種因素，如ATPS體系的組成成分及分子質量、濃度或TLL，pH值，相比Vr，溫度，樣品添加量等，評價指標包括提取率、分配系數K、純化因子等參數，綜合考慮以上影響因素及評價指標可利用多種方法達到最佳提取條件。

1.1 雙水相法提取蛋白質

ATPS提取的蛋白質主要有酶、具有治療作用的抗體、捕光色蛋白質如藻膽蛋白等。ATPS提取蛋白質的優勢在于大大降低了破壞蛋白質結構的可能性，保留其原有的活性。關于ATPS提取分離蛋白質的研究應用已有諸多報導。

Rados?aw Dembczyn'ski等［5］用環氧乙烷-環氧丙烷共聚物(EO50PO50)-K2HPO4體系從蛋清中提取溶菌酶，實驗采用了3種不同濃度的體系，綜合考慮分配系數和提取率，采用體系B(3.3%EO50PO50，13.3%K2HPO4，pH=7，0.85 mol/L NaCl，樣品添加量為稀釋3倍的7 mL蛋白)。由于EO50PO50的濁點較低，將富含EO50PO50的上相提取出來再經過加熱(高于其濁點)使其形成兩相，溶菌酶分配在富含水的上相，實驗表明經過2次ATPS提取后提取率、純化因子和酶活分別為85%，16.9，32，300 U/mg。應用溫度誘導分離型聚合物的ATPS提取溶菌酶有利于相成分的循環再利用，可降低生產成本。Aguilar等［6］用聚乙二醇(PEG)-磷酸鉀鹽ATPS提取由大腸桿菌重組菌生產的青霉素酰化酶，實驗表明最優參數為PEG 1 450 g/mol，系線 TLL 48.5%，相比 Vr=1.0，pH=7，樣品添加量35%時，上相純化因子和提取率達分別為3，97%。此外，將ATPS法與色譜法提取青霉素酰化酶的實驗成本進行比較，ATPS法的花費減少了37%。成本降低是由于操作單元的減少。因此證明ATPS法適于提取青霉素酰化酶及具有規模化生產的前景。

關于ATPS法提取具有治療作用的蛋白質已有廣泛研究報導。Platis等［7］研究采用PEG-磷酸鉀鹽ATPS提取在轉基因煙草中表達的HIV單克隆抗體2F5(mAb2F5)，在最優條件下PEG 1 500 g/mol 12%，K3PO413%，pH=5，提取率和純化因子分別為95%，3～4。Rosa等［8］用含有化學改性 PEG 的ATPS提取由中國倉鼠卵巢細胞生產的人體免疫球蛋白gamma(IgG)，在血清中，IgG是含量最多的免疫球蛋白，其具有重要的免疫作用。實驗表明，用含有150 g/mol PEG-COOH的PEG-葡聚糖(簡寫Dex)體系提取IgG，IgG的純化因子和提取率分別為1.9，93%。ATPS中添加化學物質如修飾的聚合物、金屬離子、極性溶劑等可提高目標物的選擇性，提高目標物的產率和純度。目前，國內外已開展了應用親和雙水相(聚合物上耦聯特定的親和配基)提取蛋白質的研究，表1為近年來應用親和雙水相提取蛋白質的實例。

表1 親和雙水相法提取蛋白質的實例Table 1 some examples of aqueous two-phase affinity partitioning systems for recovery and purification of proteins

由于人們越來越重視合成色素對人體健康的危害，所以在食品和化妝品行業中關于提取純化有色化合物的研究越來越多。某些天然有色化合物在分子技術領域中可以作為熒光標記。存在于藻類和藍細菌中的藻膽蛋白是一種重要的捕光色蛋白，這種蛋白可作為天然色素使用。Benavides［17］等用 PEG-磷酸鉀體系從紫球藻中提取純化B-藻紅蛋白(BPE)，實驗表明，最優條件為PEG1000 g/mol(29%)-磷酸鉀鹽(9%)，TLL 45%，Vr=4.5，pH=7，提取率和純化因子分別達 90%，4。Chethana等［18］用 PEG-磷酸鉀鹽從鈍頂螺旋藻中提取C-藻藍蛋白(CPC)，C-藻藍蛋白富集在PEG上相，實驗研究了PEG分子質量、系線TLL、體積比Vr、PEG濃度、鹽濃度對CPC分配行為的影響。PEG 1500分配系數K隨TLL的增加而增加，但純度降低，PEG 4000，6000 ATPS中的CPC的分配行為與體系PEG 1500相似。同樣考查了3種不同Vr(0.22，0.54，1.25)對CPC分配行為影響，Vr=0.22，CPC純化因子最大達3.4，但提取率僅為40%(PEG 4000/磷酸鹽TLL14%)。實驗條件在pH 7.0，PEG4000 6%，磷酸鹽 15%，Vr 0.25，純化因子和提取率達4.32，79%，實驗結果表明此ATPS適于提取鈍頂螺旋藻中的CPC。

1.2 雙水相法提取遺傳物質

關于ATPS法提取純化遺傳物質的研究已有報道，如質粒 DNA 載體。Trindade 等［19］用 PEG-(NH4)2SO4體系提取質粒DNA(pDNA)載體。實驗從大腸桿菌細胞溶解產物中提取質粒DNA載體，體系條件為PEG 600 34%，(NH4)2SO46%，Vr=9.3樣品添加量20%，pDNA完全分配在下相，提取率達100%，pDNA濃縮了3倍。為了實現工藝過程強化，樣品添加量從20%提高到40%，樣品添加量40%為時，提取率達為85%，pDNA濃縮了8倍。

Duarte等［20］用ATPS法提取pDNA與聚合物相連的一種復合物，此種復合物是一種可用于基因治療的基因載體。采用2種ATPS體系(600 g/mol PEG-(NH4)2SO4和350 g/mol PEG-Dextran 110)連續進行提取，將聚乙二醇化聚乙烯亞胺(pPEI)添加到第二階段的ATPS體系中，pPEI作為親和配體可與目標物定向結合，可提高雙水相對目標物的選擇性。經過2種ATPS萃取后RNA和雜蛋白被完全分離去除，目標復合物的提取率達到100%，雖然用超濾膜將目標物與PEG和Dextran分離時會使目標物產率損失5%～10%。但實驗證明了親和雙水相對于質粒復合物的提取具有潛在的應用價值。

Matos等［21］用2次ATPS從PCR中提取小片段DNA，首先用PEG4000-聚丙烯酸鹽24000ATPS提取DNA，PCR分配在富含 PEG的上相，再將上相與Na2SO4組成雙水相，DNA分配在富含Na2SO4的下相，蛋白質和大分子DNA被除去，小片段DNA(小于4000 bp)的提取率達95%。

1.3 雙水相法提取小分子物質

近年來，具有高附加值的小分子物質成為研究熱點，應用ATPS法提取小分子物質的研究也逐漸增加。Zhi jian Tan等［22］用ATPS法從蘆薈中提取具有抗氧化作用和藥用價值的蒽醌類化合物(AQs)，實驗考查了不同小分子醇與(NH4)2SO4組成的雙水相提取AQs，結果表明采用正丙醇-(NH4)2SO4體系提取率最高，條件為 25℃下，正丙醇 17.84%，(NH4)2SO426.66%，AQs的最高提取率達95.56%。

Peretra 等［23］用PEG-聚丙烯酸鈉(NaPA)-Na2SO4提取克拉維酸，實驗首先考查聚合物PEG(2000，4000，6000)和聚丙烯酸鈉對克拉維酸的影響，結果表明2種聚合物對其沒有降解。研究NaCl和Na2SO4對克拉維酸分配系數 K的影響，添加Na2SO4體系的K值高于添加NaCl的，與NaCl相比Na2SO4對克拉維酸分配在富含PEG上相的作用更強。體系條件為 PEG4000 10%，NaPA8000 20%，Na2SO46%，K值為9.15。此體系中克拉維酸的K值高于PEG-磷酸鉀ATPS(K=8.2)，證明這種ATPS體系適合克拉維酸的初步純化。

孫晨等［24］采用脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO-7)-NNa3PO4·12H2O雙水相提取L-苯丙氨酸，實驗考察了不同鹽(NaCl、Na2SO4、NNa3PO4)、AEO-7 含量、提取時間、加入L-苯丙氨酸的含量和溫度對L-苯丙氨酸提取率和分配系數的影響，當條件為AEO-7的體積濃度為8%，NNa3PO4·12H2O的質量濃度為85 g/L，溫度40℃，L-苯丙氨酸的質量濃度為0.532 8 g/L，提取時間60 min，L-苯丙氨酸的提取率和分配系數分別為98.7%，15.3，實驗表明AEO-7 /NNa3PO4ATPS適于提取L-苯丙氨酸

1.4 雙水相法提取細胞及細胞器

ATPS法提取細胞，主要應用包括細胞分選、細胞器的分離。熊霞等［25］采用ATPS純化大鼠背根神經節細胞質膜，差速離心后得到的質膜濃度提高了2.3倍。Edahiro［26］采用PEG-Dex提取花青素含量較高的草莓細胞，花青素含量差異大的細胞被分開，分成2個細胞群。ATPS中添加1.8 mmol/kg磷酸鉀緩沖液，培養10 d花青素含量高的草莓細胞完全分配在下相。Morre等［27］采用ATPS法從哺乳動物細胞中提取質膜和高爾基體，質膜純度達85%，離心后下相高爾基體濃縮了3.5倍。與上相的親和力由小到大依次為內質網、線粒體、高爾基體、溶菌酶和核內體、質膜。ATPS法適于提取細胞及細胞器。

2 雙水相與其他其他新技術的集成

為更高效的提取分離目標物，采用ATPS與其他新技術集成。主要包括:(1)與雙向電泳技術結合，主要應用與蛋白質提取方面以得到相關信息;(2)與微流控制技術相結合，通過流體動力學提高傳質速率來提高提取分離效果;(3)與高速逆流色譜技術結合，有效的將ATPS萃取技術與色譜分離結合在一起，高效的提取純化目標物質;(4)雙水相與溫度誘導相分離、磁場作用、超聲波作用、氣溶膠技術等常規技術實現集成化，改善了雙水相萃取技術中的一些問題，如成相聚合物回收困難、相分離時間較長、易乳化等。

2.1 雙水相與雙向電泳技術結合

ATPS與雙向電泳(2-DE)技術結合主要應用與蛋白質提取方面，通過雙向電泳圖譜得到蛋白質的一些相關信息如分子質量、等電點(pI)、表達水平。雙向電泳具有簡便、快速、高分辨率和重復性等優點，克服了SDS-PAGE的一些不足，如SDS-PAGE很難檢測到低豐度蛋白，聚合蛋白質，疏水蛋白。Gu和Glatz［28］將雙水相PEG3350(15.7%)Na2SO4(8.9%)-NaCl(3%)與雙向電泳結合得到蛋白質特性的3D圖，包括等電點pI、分子質量MW和表面疏水性SH。得到玉米胚芽蛋白的3D圖，與pH=7的玉米胚芽提取物相比，pH=4時提取物蛋白質較少、疏水性強、分子量小。

2.2 微流控制與雙水相技術結合

微流控制分離通過改變幾何形狀來影響兩相間的流動模式和界面形狀，從而提高界面間的傳質速率和目標物的提取率。近年來，微流控制技術與ATPS結合的研究已受到關注。黃宇石等［29］用 PEG-(NH4)2SO4體系提取糖化酶，實驗設計了提取分離的微流控裝置，研究了微通道內的雷諾層流條件，并將了微流控和燒杯中的ATPS(PEG24%，(NH4)2SO420%，Vr=1，糖化酶酶粉0.03g)溶液進行了對比實驗，微流控萃取的傳質速率是燒杯中的2.8倍，微通道和燒杯中單位雙水相體積單位時間的傳質量分別為127.15，2.96 g/cm3·s，前者是后者的 42 倍，微流控制與ATPS技術相結合，提供了兩相較快的環隙流動速度和較大的傳質比表面積，微流控雙水相萃取效果遠優于普通燒杯中萃取。

SooHoo［30］將 ATPSPEG-葡聚糖(簡寫 Dex)與微流控制結合從全血中提取白血球，實驗根據微流裝置的層流流動特點，考查聚合物間無穩定界面(不相融的PEG-PEG-Dex)，一個穩定界面(不相融的 Dex-PEG-Dex)，2個穩定界面(PEG-PBS(磷酸鹽緩沖液)-Dex)3種萃取情況，結果表明提取效果最好的配置是Dex-PEG-Dex，其白細胞與紅細胞之比是樣品的9.13倍。

Meagher等［31］應用微流控制雙水相法，結果表明可除去約85%的雜蛋白。Yushi Huang［32］等用微流控制雙水相法提取牛血清蛋白，3個周期提取僅用3.6s，牛血清蛋白提取率達71%，結果優于普通雙水相。

2.3 高速逆流色譜與雙水相結合

郅文波等［33］采用高速逆流色譜與 PEG1000-磷酸鉀鹽ATPS相結合對標準蛋白質混合物以及卵白蛋白進行分離，結果表明 PEG1000 15%，K3PO4鹽17%，pH 9.2，高速逆流色譜流速0.8 mL/min，轉速850 r/min，成功分離細胞色素C、溶菌酶和肌紅蛋白的混合物，PEG1000 16%，K3PO417%，pH 9.2，高速逆流色譜流速1.8 mL/min，轉速850 r/min，200 min內從雞蛋蛋清樣品中分離卵白蛋白，其電泳純度為100%，收率達95%。

Liu等［34］將高速逆流色譜與 ATPS乙醇-(NH4)2SO4相結合成功分離4種核苷，雙水相條件為乙醇27%，(NH4)2SO421%，高速逆流色譜以上相作為流動相，流動方向從頭到尾，流速0.7 mL/min，轉速800 r/min，分離了4種核苷腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷。

2.4 雙水相與其他技術相結合

Lopes等［35］采用溫度誘導雙水相體系從大腸桿菌發酵液中提取綠色熒光蛋白和除去內毒素，結果表明，綠色熒光蛋白的提取率達96%且除去了99%的內毒素。翟素玲等［36］采用雙水相電泳(PEG-Dex)分離氨基酸，結果表明，ATPS萃取過程中外加電場使苯丙氨酸和色氨酸的分離效果有明顯的提高，延長分離時間或提高電場強度使苯丙氨酸萃取率達到90%以上，基本實現完全分離。Save等［37］將ATPS萃取與氣溶膠技術結合，實驗考察了淀粉轉葡糖苷酶的傳質性能，傳質系數 K高于噴射床，表明ATPS萃取結合氣溶膠技術有效提高了萃取柱的傳質性能。

3 雙水相技術面臨的問題及展望

ATPS萃取技術克服了有機溶劑使生物粒子變性作用，其操作條件溫和適于提取生物制品。對于蛋白質、遺傳物質、小分子物質、細胞、細胞器的提取分離已有許多的研究，但雙水相萃取技術還面臨很多問題:(1)對于ATPS機理研究還不夠成熟，需進一步的深入研究。ATPS組分間作用比較復雜，目標物的分配行為受表面性質、電荷作用與其他作用力的影響。關于物質在ATPS體系間的分配行為的研究比較少，缺乏理論或模型解釋;(2)ATPS萃取生物制品雖具有粗分離的作用，但同時也引入成相物質且目標物與成相物質難于分離，對后續分離工藝不利，分離過程產生的成相物質的溶液難于回收利用;(3)ATPS萃取的研究多數建立在實驗基礎上，缺乏對于相際間傳質傳遞的動力學研究。所以作為一種重要的提取純化的技術方法ATPS萃取應用于工業生產還面臨諸多問題。

目前，在生物制藥業中，下游加工過程的費用占總成本的40%～70%，因此，關于降低ATPS生產成本的研究也不斷增加。降低ATPS生產成本的方法主要有:(1)降低ATPS組成成分的成本，開發廉價ATPS體系;(2)ATPS相成分循環再利用。Ghosh等［38］用廉價的 DexT40代替昂貴的 DexT50，用變性淀粉、乙基羥乙基纖維素等代替昂貴的葡聚糖，用羥基纖維素、聚乙烯醇等代替PEG，可制成廉價的ATPS體系。Dembczyński等［39］用 EO50PO50-K2HPO4溫度誘導 ATPS體系提取溶菌酶，研究了相成分EO50PO50和K2HPO4的循環再利用提取溶菌酶。但ATPS萃取生物制品仍有巨大潛在的價值，研究人員也在不斷探索以解決以上所面臨的問題。

ATPS萃取技術未來發展的方向主要包括2個方面:(1)所有理論研究不能脫離實際應用，ATPS萃取技術的發展應適于大規模的工廠生產，要相對容易建立投產這就離不開技術集成化和提高ATPS萃取技術本身的優勢，在萃取的同時達到分離以節省后續分離的麻煩，使其在應用中可減少成本的投入;(2)同時生產應用離不開理論基礎研究，ATPS萃取技術所面臨的問題正是理論研究亟待解決的，ATPS體系熱力學和動力學機理研究的不斷深入也是此技術未來發展的一大挑戰。

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